肝复健方对大鼠免疫性肝纤维化的干预作用及机制

娄莹莹 李佃贵 王彦刚 张 纨 孙润雪 霍耐月

(河北省中医院，河北 石家庄 050017)



肝复健方对大鼠免疫性肝纤维化的干预作用及机制

娄莹莹 李佃贵 王彦刚 张 纨 孙润雪 霍耐月

(河北省中医院，河北 石家庄 050017)

目的 观察以“浊毒”立论的肝复健方抗大鼠肝纤维化(HF)的作用及机制。方法 SD大鼠腹腔注射猪血清 0.5 ml，2次/w，连续8 w制备HF模型，每天灌胃分别给予不同剂量的肝复健方和秋水仙碱治疗至12 w末。实验结束后，观察肝组织病理改变，放射免疫分析法检测血清透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、Ⅳ型胶原(CⅣ)、瘦素(Leptin)水平，RT-PCR法检测基质金属蛋白酶(MMP)-1 mRNA的表达。结果 所有给药组肝脏损伤程度均较模型组减轻，肝复健方高剂量组肝脏结构改善最为明显。与模型组比较，肝复健方各给药组血清HA、LN、PCⅢ、CⅣ、Leptin水平明显降低(P<0.05),与对照组比较，模型组及各药物组MMP-1表达明显减弱；经肝复健方治疗后大鼠肝脏MMP-1表达均比模型组增强。结论 肝复健方能降低血清Leptin水平，增强MMP-1的表达，减轻免疫性HF大鼠的肝细胞损伤，调节细胞外基质的代谢，从而阻止或逆转HF。

肝复健方；免疫性肝纤维化；血清标志物；瘦素；基质金属蛋白酶-1

肝病是我国常见多发病，严重影响患者生存率及生活质量。肝纤维化(HF)是各种慢性肝病向肝硬化发展的必经阶段，但尚属于可逆阶段，故HF的防治、逆转成为阻断这一恶性发展链的关键环节。以“浊毒”立论的肝复健方是李佃贵教授治疗HF的有效经验方，临床证实疗效确切，本实验进一步探讨该方抗HF作用及深层机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级SD大鼠60只，雄性，体重(200±20)g，由河北医科大学实验动物中心提供(合格证号 1105033)。

1.2 药品 肝复健方由茵陈、田基黄、绞股蓝、白花蛇舌草、虎杖、黄连、黄柏、鳖甲、山甲珠、三棱、红景天、丹参、当归、白芍等组成，生药购自河北省中医院中药房。河北省中医院煎药房煎煮，灭菌分装，4℃保存。无菌未灭活猪血清(购于北京燕生政博生物科技有限责任公司)；

1.3 试剂与仪器 透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、Ⅳ型胶原(CⅣ)、瘦素(Leptin)放免试剂盒，购自北京中山生物技术有限公司。Trizol(美国Invitrogen公司)；DEPC(美国Sigma公司)； PCR扩增仪(美国PE公司)；电泳仪及电泳槽(北京六一仪器厂)等；

1.4 方法

1.4.1 免疫性HF模型制备 适应性喂养1 w后，造模采用腹腔注射猪血清法，2次/w，猪血清0.5 ml/只，周一、周五上午9点，共8 w。

1.4.2 分组及给药 大鼠随机分为6组：即正常对照组、模型组、秋水仙碱组、肝复健方低、中、高剂量组，每组10只。正常对照组、模型组给予生理盐水灌胃；肝复健方低、中、高剂量组分别给予含生药1.4、2.8、4.2 g/ml水煎剂灌胃；秋水仙碱组给予秋水仙碱0.154 g·kg-1·d-1灌胃至12 w末。

1.4.3 指标观察

1.4.3.1 肝组织病理学观察 常规制备肝组织切片，HE和Masson染色，观察肝组织病理学改变。

1.4.3.2 血液相关生化指标检测 放射免疫分析法检测血清HA、LN、PCⅢ、CⅣ水平，各组大鼠干预后血清Leptin水平。方法参照试剂盒说明操作。

1.4.3.3 RT-PCR半定量检测肝组织基质金属蛋白酶(MMP)-1 mRNA的表达 引物序列依据文献报道设计，由北京塞百盛基因技术有限公司合成。扩增的MMP-1 基因序列上游引物:5'-CCCATCCAGCCAACAGGT-3'，下游引物：5'-CTTCTGCTGTTAATCTAG -3'，扩增产物大小为457 bp；GAPDH上游引物：5'-CCTTCATTGACCTCAACTAC-3',下游引物：5'-GGAAGGCCATGCCAGTGAGC-3'，扩增产物大小为594 bp。PCR反应条件： 94℃变性3 min；然后94℃40 s，55℃50 s，72℃90 s(30个循环)；72℃延伸10 min。PCR产物经1%的含GV核酸染料的琼脂糖凝胶电泳，以DNA Marker(DL2000)作为标准片段标记，电泳后于紫外透射仪观察，并用数码相机照相，输入微机应用凝胶图像分析软件对目的电泳条带进行分析，以相应的内参电泳条带作为参照，结果以两者之积分吸光度的比值表示。

1.5 统计学方法 应用SPSS13.0统计软件进行t检验，单因素方差分析，SNK-q检验。

2 结 果

2.1 对HF大鼠肝组织病理形态学的影响 模型组大鼠肝小叶结构可见破坏，肝细胞索排列紊乱，肝细胞变性，部分肝细胞坏死，可见大量中性粒细胞及淋巴细胞，纤维组织增生，个别动物可见假小叶形成。秋水仙碱组与肝复健方治疗各组肝脏损伤程度均较模型组轻，肝复健方高剂量组肝脏结构改善最为明显，秋水仙碱组与肝复健方中剂量组肝脏病变相当，肝复健方低剂量组大鼠肝脏炎症和纤维化程度最重。

2.2 对免疫性HF大鼠血清HA、LN、PCⅢ、CⅣ、Leptin的影响 如表1、表2所示，与正常对照组相比，模型组大鼠血清HA、LN、PCⅢ、CIV、Leptin水平升高(P<0.01)。与模型组相比，各药物干预组大鼠血清HA、LN、PCⅢ、CⅣ、Leptin水平下降(P<0.01)。肝复健方高剂量组水平降低最为明显。

组别HA(ng/ml)LN(ng/ml)PCⅢ(ng/ml)CⅣ(ng/ml)正常对照组39.9010±1.675231.3973±3.012143.5753±2.34799.4868±0.8909模型组71.8248±1.84071)66.8759±1.83211)73.4265±1.97631)19.0318±1.28611)秋水仙碱组47.2102±1.58881)2)53.0735±2.67461)2)54.2876±1.40251)2)13.4126±0.96541)2)肝复健方低剂量组53.0892±1.55251)2)3)62.8055±1.95051)2)3)63.2639±2.21901)2)3)15.6840±0.99671)2)3)肝复健方中剂量组46.9040±1.53131)2)52.1196±2.34371)2)54.4389±1.89361)2)13.3490±1.00471)2)肝复健方高剂量组42.9793±1.15011)2)3)39.7432±3.16101)2)3)50.0175±2.06131)2)3)11.7406±0.90151)2)3)

与正常对照组比较：1)P<0.05；与模型组比较，2)P<0.05；与秋水仙碱组比较:3)P<0.05，下表同

2.3 对免疫性HF大鼠肝组织MMP-1 mRNA的表达的影响 模型组及各药物治疗组MMP- 1 mRNA的表达均较正常对照组减弱(P<0.05)。各药物治疗组与模型组比较，MMP- 1 mRNA表达明显增强(P<0.05)。其中，肝复健方高剂量组MMP-1 mRNA的表达显著性增强，优于其他治疗组(P<0.05)，秋水仙碱组与胶复健中剂量组比较MMP-1 mRNA的表达有增强趋势，但均无显著性差异(P>0.05)。秋水仙碱组与肝复健低剂量组比较，MMP-1 mRNA的表达增强(P<0.05)。见表2、图1。

组别Leptin(ng/ml)MMP-1/GAPDH正常对照组9.035±0.41210.5167±0.0278模型组14.878±0.63081)0.1766±0.03041)秋水仙碱组11.736±0.42161)2)0.3689±0.28561)2)肝复健方低剂量组13.305±0.42271)2)3)0.2544±0.09331)2)3)肝复健方中剂量组11.854±0.49831)2)0.3335±0.01511)2)肝复健方高剂量组10.804±0.37701)2)3)0.4112±0.01761)2)3)

M:Marker；1:正常对照组；2:模型组；3:肝复建方低剂量组；4:肝复建方中剂量组；5:肝复建方高剂量组；6:秋水仙碱组；MMP-1为457 bp，GAPDH为594 bp图1 肝复健方对HF大鼠肝组织MMP-1 mRNA基因表达的影响

3 讨 论

HF是引起肝脏功能障碍和肝硬化的病理基础，是肝脏纤维组织过度沉积的过程，表现为细胞外基质(ECM)的合成大于降解。中医学将HF归属于黄疸、胁痛、臌胀等疾病的范畴。肝复健方是李佃贵教授在浊毒理论指导下拟定而成，方中茵陈、田基黄化浊解毒为君药；虎杖活血兼解热毒利湿浊；绞股蓝、白花蛇舌草清热解毒，寒凉清泻以降浊；黄柏、黄连苦寒燥浊，双管齐下，共奏化浊解毒功效，共为臣药。三棱破血行气消积；鳖甲滋养肝肾，软坚散结；山甲珠活血散瘀、通行经络；白芍柔肝养肝血；当归、丹参养血活血；红景天益气活血，清热解毒，共为佐使之用。诸药合用，浊毒可去，气血调畅，肝复如常。

本文结果显示，肝复健方可改善HF大鼠肝组织病理学形态，且高剂量组疗效最为明显。HA、LN、PCⅢ、CⅣ是ECM的主要成分。研究证实，肝复健方具有一定的调节ECM代谢的作用，可能是通过减少血清HA、LN、PCⅢ、CⅣ的合成，促进ECM的降解而达到抗纤维化的作用。

各种细胞因子形成复杂的调节网络影响HF的形成和转归〔1〕。Leptin是一个关键促纤维化因子，具有细胞因子的特性，通过与相应的受体Ob-R结合发挥作用〔2〕。Ormarsdottir等〔3〕和Ruhl等〔4〕发现，对于慢性肝病患者，血清Leptin水平可显著增高。对于HF大鼠，Leptin水平与HF的程度呈正比〔5〕。研究结果显示，模型组血清HF水平升高，经肝复健方治疗后水平明显下降，提示可能由活化的肝星状细胞分泌Leptin增多，从而引起血清HF水平升高。肝复健方通过降低大鼠HF Leptin水平，从而减轻肝纤维化病理程度，延缓疾病进程。另有研究发现HF与Leptin受体结合后，可通过JAK-STAT途径,直接作用于(HSC)，阻碍HSC的凋亡，抑制MMP-1基因表达，促进胶原的产生〔6〕。MMPs是降解ECM最主要的酶系，MMP-1是肝脏中分解Ⅰ型及Ⅲ型胶原的主要胶原酶。本研究结果表明，模型组及各药物组MMP-1 mRNA的表达均明显减弱，经肝复健方治疗后，秋水仙碱组和肝复健方各剂量组MMP-1 mRNA表达明显增强。提示肝复健方阻碍HF发展，可能是通过增强胶原酶MMP-1的表达，提高降解活性，促进间质性胶原为主的ECM降解，从而减少纤维胶原沉积于细胞外。

综上所述，基于浊毒理论的肝复健方是较为理想的抗HF中药方，其可能通过抑制HSC合成和分泌Leptin，促进MMP-1的表达，从而使ECM降解，阻碍HF进程。

1 苏凤菊,曾令兰,李淑莉,等.姜黄素对肝纤维化大鼠瘦素及瘦素受体表达的影响〔J〕.中西医结合肝病杂志,2007;17(4):225-9.

2 Potter JJ,Rennie Tankesley L,Mezey E.Influence of leptin in the development of hepatic fibrosis produced in mice by Schistosoma mansoni infection and by chronic tetrachlorirde administration〔J〕.J Hepatol,2003;38:281-8.

3 Ormarsdottir S,Ljunggren O,Mallmin H,etal.Inverse relationship between circulating levels of leptin and bone mineral density in chronic liver disease〔J〕.J Gastroenterol Hepatol,2001;16(12):1409-14.

4 Ruhl CE,Everhart JE.Determinants of the association of overweight with elevated serum alanine aminotransferase activity in the United States〔J〕.Gastroenterology,2003;124:71-9.

5 OtteC，Otte JM，Strodthoff D,etal.Expression of leptin and leptin receptor during the development of liver fibrosis and cirrhosis〔J〕.Exp Clin Endocrinol Diabetes，2004;112(1):10-7.

6 CaoQ,Mak KM,Lieber CS.Leptin represses matrix metalloproteinase-1 gene expression in LX2 human hepatic stellate cells〔J〕.J Hepatol,2007;46(1):124-33.

〔2015-08-04修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

河北省科学技术研究与发展计划项目(No.10206427D)

娄莹莹(1984-)，女，博士，主要从事消化系统疾病的中西医结合研究。

R285.5

A

1005-9202(2016)23-5820-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.23.020