硫酸锌对糖尿病皮肤损伤的修复作用

张海峰 吕 游 王洪莎 魏 祺 雷嫚嫚 郭蔚莹

(吉林大学第一医院介入治疗科，吉林 长春 130021)



硫酸锌对糖尿病皮肤损伤的修复作用

张海峰 吕 游1王洪莎1魏 祺1雷嫚嫚1郭蔚莹1

(吉林大学第一医院介入治疗科，吉林 长春 130021)

目的 研究硫酸锌对糖尿病伴有皮肤创面愈合的影响。方法 采用链脲佐菌素(STZ)腹腔注射制备糖尿病大鼠模型(48只)，成模1个月后，进行背部9 cm2锐器皮肤损伤。尔后分2组：1组在伤愈过程中局部涂抹硫酸锌，另1组局部涂抹生理盐水自然愈合。以正常大鼠皮肤损伤为对照组(48只)。在创面愈合的不同时间点，采用创面愈合百分率计算大鼠皮肤创面愈合速度；通过免疫组织化学染色、实时定量PCR检测动态观察糖尿病创面愈合的过程及其组织学变化特征。 结果 第15天时，糖尿病硫酸锌组较盐水组愈合面积更大， 创面组织微血管密度(MVD)相比更大(均P<0.05)；增殖性细胞核抗原(PCNA)阳性细胞在糖尿病硫酸锌组较盐水组表达增高(P<0.05)；糖尿病硫酸锌组的基质金属蛋白酶(MMP)-2在第5天和第10天时间点减少，且低于盐水组(P<0.05)。糖尿病硫酸锌组的基质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)-1 mRNA含量在第5天和第10天时约为盐水组的2倍，15 d时下降低于盐水组(P<0.05)。 结论 硫酸锌对于糖尿病大鼠皮肤创面具有良好的促进愈合作用，其机制与创面MMPs表达和基质重建有关。

糖尿病；硫酸锌；伤口愈合；MMPs

由于代谢和微循环障碍的原因，很多糖尿病(DM)患者可同时合并多种皮肤疾病〔1〕，主要表现为皮肤一旦出现破溃后创面难以愈合、局部感染和糖尿病足等，而这些病变的发生与神经病变、血管病变以及DM皮肤组织的创面愈合能力低下等因素有密切关系。创伤愈合是多因素参与的病理生理过程，主要分为止血、炎症、增殖和塑形4个阶段〔2〕。除了炎症细胞、修复细胞、多种细胞因子、微量元素外，细胞外基质共同参与此过程。任何一个环节的调控异常均可导致创面愈合延迟〔3〕。锌是人体内重要的微量元素之一，是维持人体各种酶系统的必需成分。锌不仅作为酶的辅助因子参与糖、蛋白质代谢，同时还参与某些酶的激活〔4〕。当机体锌缺乏时，会出现皮肤黏膜损伤的愈合延迟，说明锌能够促进皮肤及组织损伤的生长和促进伤口愈合。此外还有数据表明，锌能够拮抗氧化应激、稳定抗氧化酶活性，在清除氧自由基的过程中发挥重要作用。锌缺乏导致抗氧化酶的抗氧化能力下降，从而导致机体内氧化应激增加〔5〕。笔者拟探讨硫酸锌对糖尿病皮肤损伤修复的影响及机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 链脲佐菌素(STZ)和硫酸锌购于美国Sigma公司，Trizol试剂盒及cDNA合成试剂购于美国Life公司，增殖性细胞核抗原(PCNA)和CD34抗体购于北京博奥森生物技术公司，SP试剂盒和DAB显色剂购于福州迈新公司，荧光定量qPCR试剂盒购于北京博奥生物公司。

1.2 动物 Wistar大鼠96只，雄性，体重180～220 g，由吉林大学基础医学院实验动物中心提供。

1.3 DM大鼠模型的建立 实验组：以50 mg/kg STZ行腹腔一次性注射。注射72 h，尾静脉取血，测血糖。出现多饮、多食、多尿现象者，且血糖>16.7 mmol/L确定为DM大鼠。成模大鼠常规饲养，每周称量体重，隔周检测血糖，持续监测8 w。非DM组大鼠用等量枸橼酸-枸橼酸钠液注射。

1.4 皮肤创伤模型的建立与分组 大鼠成模1个月之后，采用2.5%戊巴比妥钠(35 mg/kg)进行腹腔注射麻醉，脊背去毛，无菌条件下切除面积为9 cm2(直径约3.4 cm)圆形皮肤，切口深度达皮下组织全层。为避免感染，大鼠单笼饲养。大鼠随机分为锌处理组(DM/Zn组)、盐水对照组(DM/SA组)、非糖尿病组(NDM组)、非糖尿病锌组(NDM/Zn组)。每组24只。

1.5 免疫组织化学 在创伤后5、10、15 d时间点，每组分别处死8只大鼠。取少许周围正常组织和创面肉芽组织，固定，包埋。石蜡切片制成厚度为3 μm的切片，4℃条件下保存备用。采用SP试剂盒并按说明操作：切片水化后，0.01 mol/L 的PBS洗涤3 min×3；然后置于柠檬酸缓冲液中92℃～95℃保温20 min，在室温条件下自然冷却至37℃；加入50 μl 3%的H2O2室温下孵育10 min，阻断内源性过氧化酶。PBS洗涤3 min×3；加50 μl 5%山羊血清，室温下孵育10 min；切片滴加50 μl抗体PCNA 或CD34(免抗-CD34，兔抗-PCNA)；4℃孵育过夜。PBS冲洗3 min×3次，加50 μl生物素标记的二抗，室温孵育10 min，PBS洗，3 min×3次；然后滴加50 μl 链霉菌抗生物素-过氧化酶溶液，室温孵育10 min，PBS洗，3 min×3；加入DAB溶液显色，苏木精复染，酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。设有PBS(代替一抗)的阴性对照。结果判定采用KS400图像分析系统(德国Kaiser公司)分析。

1.6 数据分析 显微图像采集及分析创面微血管密度(MVD)计数：采用抗CD34抗体标记皮肤切片组织中的血管内皮细胞，以孤立的棕黄色血管内皮细胞或细胞簇为1条单独的微血管，参考Pareek等〔6〕的计数方法进行计数，取平均值。创面愈合面积百分比计算：采用Adobe Image Ready7.0和Osiris软件进行面积计算。在伤后24 h进行创面面积第1次测量为初始创伤面积；于取材时测量各时相点创面面积，愈合面积=初始创面面积-各时相点面积。创面愈合面积百分比=愈合面积/初始创面面积×100%。创缘局部PCNA的表达测定采取KS400图像分析系统(德国Kaiser公司)分析：切片置于光学显微镜低倍镜下观察，以细胞核呈现明确的棕黄色颗粒状染色为阳性细胞，细胞核蓝染的细胞为苏木精复染的阴性细胞，随机在镜下选择均匀视野，计数100个细胞中阳性细胞所占的比例。

1.7 实时qPCR检测基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、基质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)-1在转录水平的变化 通过Trizol法提取皮肤组织中的总RNA，从提取得到的总RNA中取10 μl进行逆转录。得到的cDNA产物，使用晶芯RT-Cycler实时荧光定量PCR仪进行PCR扩增，引物序列：MMP-2上游引物5′-ACC ATC GCC CAT CAT CAA GT-3′，下游引物5′-CGA GCA AAA GCA TCA TCC AC-3′；MMP-9，上游引物5′-AGT TTG GTG TCG CGG AGC AC-3′，下游引物5′-TAC ATG AGC GCT TCC GGC AC-3′；TIMP-1上游引物 5′-CCA CCT TAT ACC AGC GTT ATG-3′，下游引物5′-GGC AAA GTG ATC GCT CTG-3′；内参β-actin上游引物5′-ACCACAGCTGAGAGGGAAATCG-3′，下游引物5′-AGAGGTCTTTACGGATGTCAACG-3′ 。扩增程序：预变性95℃、10 min；94℃、1 min，60℃、30 s，72℃、50 s， 40个循环；每个循环在延伸75℃时读板，收集荧光值。得到的结果以β-actin基因作为内参照，计算PCR产物相对量。mRNA的相对表达根据公式Fold change=2-ΔΔCt,ΔCt = Ct(target)- Ct(β-actin),Δ(ΔCt)=ΔCt(treated)-ΔCt(untreated)。

1.8 统计学方法 采用SPSS11.0软件做单因素方差分析。

2 结 果

2.1 各组大鼠干预治疗前后愈合能力的比较 损伤后15 d，DM组大鼠皮肤创面大部分尚未愈合，非DM组大鼠皮肤创面已基本愈合。定量分析愈合面积，在损伤后5、10、15 d，创面愈合面积百分比显著减少(P<0.05)，表明DM大鼠创面存在难以愈合及愈合延迟的现象。在15 d，硫酸锌处理组的愈合率明显高于盐水组(P<0.05)。正常大鼠皮肤创面应用硫酸锌处理与未处理组无明显差别(P>0.05)。见表1。

2.2 免疫组化PCNA、CD34阳性细胞的表达 CD34和PCNA主要表达在皮肤创面组织的间质细胞和毛细血管内皮细胞，DM/Zn组CD34表达阳性细胞数量与DM/SA组比较明显增加(见图1)。DM组大鼠皮肤创面MVD值在伤后5、10和15 d均明显低于非DM组(P<0.05)；第15天时，锌处理组与盐水组MVD值相比较更多(P<0.05)。见表2。在DM/Zn组中PCNA的表达阳性细胞数增多，与DM/Zn组相比具有统计学差异(P<0.05)。正常大鼠皮肤创面应用硫酸锌处理与未处理组无明显差别(P>0.05)。见表3。

组别5d10d15dDM/Zn组11.48±3.5138.73±6.101)2)59.05±8.601)2)DM/SA组11.31±2.6133.24±5.1748.78±8.56NDM/Zn组28.98±6.0574.34±8.5086.88±9.30NDM组27.64±5.6472.15±10.9985.45±7.53

与DM/SA组比较：1)P<0.05；与5 d比较：2)P<0.05；下表同

组别5d10d15dDM/Zn组8.00±2.0011.67±1.531)2)15.33±1.531)2)DM/SA组5.67±1.157.67±0.589.67±0.58NDM/Zn组13.86±3.2026.88±2.9620.86±1.02NDM组12.00±2.6524.00±2.0021.00±1.00

图1 CD34和PCNA在DM大鼠皮肤损伤创面组织中的表达(Bar=50 μm)

2.3 DM皮肤缺损愈合过程中MMP-2、MMP-9及TIMP-1基因转录水平的变化 非DM组中第5天时，MMP-2和MMP-9转录增强，10 d时下降，至第15天时显著下降；TIMP-1在第5天和第10天保持恒定，第15天显著下降。DM/Zn组的MMP-2在第5天和第10天保持恒定，第15天显著下降；MMP-9在第5天、第10天时呈现逐渐增加趋势，而至第15天时则显著减少，低于DM/SA组(P<0.05)。DM/Zn组的TIMP-1 mRNA含量在第5天和第10天时约为DM/SA组的2倍，15 d时下降低于DM/SA组(P<0.05)。见图2～图4。

图2 MMP-2 mRNA在大鼠皮肤创面组织的表达变化

图3 MMP-9 mRNA在大鼠皮肤创面组织的表达变化

图4 TIMP-1 mRNA在大鼠皮肤创面组织的表达变化

3 讨 论

创面愈合是一个错综复杂的生物学过程〔7〕，对于皮肤创面的愈合过程影响最大的主要有三方面：血管病变、神经病变和高血糖所导致的氧化应激，其中任何一个环节的协调不稳定均可以导致创面愈合的延迟。

微量元素锌不仅能够参与脂质和蛋白质代谢酶的辅助因子，同时锌也是许多葡萄糖代谢酶的构成部分，在能量代谢过程中起重要作用。锌在胰岛素中含量很高，能够增强胰岛素稳定性，锌还能在受体水平调控胰岛素信号转导，增强降血糖作用〔8〕。Miranda等〔9〕发现锌通过增强胰岛素受体的酪氨酸磷酸化过程，使葡萄糖摄取与利用明显增加；同时，锌具有一定的类胰岛素样活性，在不依赖于胰岛素的条件下，锌同样可使胰岛素受体发生酪氨酸磷酸化。本研究表明，硫酸锌可部分降低血糖浓度。

有研究表明，锌作为清除氧自由基过程中的重要因子，能够维持抗氧化酶稳定性〔10〕。Soinio等〔11〕的临床研究显示，血清中与含锌水平正常的DM患者相比较，含锌水平较低的DM患者患心血管疾病的风险要更高，而且单独补锌对于含锌水平较低的DM患者提高血清中含锌水平，控制血糖水平有显著效果。金属硫蛋白(MT)是一种重要的内源性细胞保护蛋白，具有清除氧自由基的作用，是体内重要的抗氧化物质。Tang等〔12〕将MT siRNA沉默的心肌细胞用锌处理与对照组的抗氧化能力并无显著差别，表明锌的抗氧化作用是通过其诱导产生的金属硫蛋白实现，而不是依靠锌本身实现的。本研究结果表明，硫酸锌外用可促进局部细胞增殖和微血管增生，对糖尿病大鼠皮肤创面具有良好的促进愈合作用。

以往研究证明，MMP/TIMP的动态平衡在创口愈合的过程中对控制创伤修复的结局至关重要。TIMPs作为MMPs的抑制因子，能有效抑制MMPs诱导的细胞外基质降解，进而调控基质重塑和促进新生血管生成。TIMPs的不足可导致创面迁延不愈或慢性的伤口形成〔13〕。本研究显示，锌可能通过调控皮肤创面局部组织的MMP/TIMP的表达变化参与皮肤损伤修复。

尽管目前锌促进DM患者创面愈合的机制仍不明，但是本实验以及前人的结果证实，作为人体必需的微量元素，锌对DM患者创伤愈合具有非常重要的意义。

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〔2016-09-28修回〕

(编辑 曲 莉)

国家自然科学基金(81300660);吉林省发改委(2013C029-3);吉林省(白求恩专项)自然科学基金(20160101035JC)

1 吉林大学第一医院内分泌科

郭蔚莹(1974-)，女，副教授，主要从事内分泌代谢学研究。

张海峰(1975-)，男，副教授，主要从事介入治疗学研究。

R587

A

1005-9202(2016)23-5777-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.23.004