化瘀开窍解郁颗粒对脑卒中后抑郁大鼠的保护作用

喻 斌 张臻年 黄仕文 杨 丽 邹 杰 程海波 沈祥春

(南京中医药大学，江苏 南京 210023)



化瘀开窍解郁颗粒对脑卒中后抑郁大鼠的保护作用

喻 斌 张臻年1黄仕文 杨 丽 邹 杰 程海波 沈祥春2

(南京中医药大学，江苏 南京 210023)

目的 探讨化瘀开窍解郁颗粒(HY颗粒)对脑卒中后抑郁(PSD)大鼠的改善作用及机制。方法 首先对大鼠MCAO处理，再进行慢性应激刺激两步完成PSD模型的复制，给药后观察HY颗粒对大鼠糖水消耗、开场活动情况的影响，以及对水迷宫实验中游泳时间、游泳距离、游泳速度、近站台区游泳距离、远站台区游泳距离、近/远站台区距离比、近站台区时间、远站台区时间、近/远站台区时间比的影响。通过免疫组织化学法观察HY颗粒对海马和皮层(额叶)中脑源性神经营养因子(BDNF)和神经生长因子(NGF)表达的影响。结果 HY颗粒治疗后可显著增加PSD大鼠体重、糖水消耗体积、水平活动次数、垂直活动次数，缩短总游泳距离、近站台区的游泳距离、远站台区的游泳距离、游泳时间、近站台区游泳时间、远站台区游泳时间，增加近/远站台区游泳距离比和时间比。HY颗粒还可剂量依赖性增加海马和皮层脑区中BDNF和NGF蛋白的表达。结论 HY颗粒能促进PSD大鼠行为学改善，其机制涉及BDNF和NGF表达量的增加。

化瘀开窍解郁颗粒；脑卒中后抑郁

脑卒中后抑郁(PSD)患者除了表现情绪低落、兴趣减少外，还往往出现严重负罪感、睡眠障碍、思维能力减弱、自杀倾向〔1〕。PSD不仅对神经系统功能的恢复不利，甚至还可能促使脑损伤恶化，加重影响患者的生活质量。现代医学对于PSD的治疗主要采用抗抑郁药物，如舍曲林等，但效果并不理想，并且还可带来如消化系统和神经系统的副作用〔2〕。传统医学认为PSD的病机在于气滞血瘀，情志不舒，肝气郁结，气机失调，心失所养，故其治疗应采用活血化瘀、开窍理气、疏肝解郁法为主。基于该理论形成的化瘀开窍解郁治法临床疗效较好，本实验室根据该方已制备化瘀开窍解郁颗粒(HY颗粒)。本实验拟进一步阐明HY颗粒对PSD的药理作用及初步机制。

1 材料与方法

1.1 材料 清洁级SD大鼠(体重180～220 g)，雄性，购于浙江大学实验动物中心。HY颗粒，本实验室制备，该方含丹参、石菖蒲、川芎、柴胡、广郁金、茯神、香附、枳壳、青皮、红花、桃仁、当归、竹茹、冰片和甘草。帕罗西汀购于葛兰素史克公司，批号14110503。Morris水迷宫行为学系统(淮北正华有限公司)，配合Any-maze行为学分析软件(美国Stoeling公司)。

1.2 方法

1.2.1 分组 60只大鼠，随机分为正常组、PSD组、阳性药组(帕罗西汀1.65 mg/kg)、HY颗粒-Ⅰ组(13.35 g/kg)、HY颗粒-Ⅱ组(26.7 g/kg)和HY颗粒-Ⅲ组(53.4 g/kg)，每组10只。

1.2.2 PSD造模和给药方法 按照Kim等〔3〕方法进行PSD造模。大鼠用水合氯醛麻醉(350 mg/kg，ip)，仰卧于鼠板上。颈正中切口，依次分离左侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)，结扎ECA远端并烙断。结扎CCA近心端以及ECA和翼腭动脉。距CCA分叉处近心端 0.5 cm处插入备好的尼龙线，去除动脉夹，沿着ICA轻轻向前推至指定长度〔(18±0.5)cm〕后，将ICA和鱼线一起固定后缝合皮肤。正常组大鼠手术过程相同，但不插入尼龙线。每日给予青霉素(ip，10万U/只)，连续3 d。以大鼠出现Horner症状作为PSD模型成功的标志。按文献方法进行抑郁模型的复制〔4〕。每只用小鼠笼单独饲养并接受21 d的慢性应激刺激，具体包括1 d的昼夜颠倒、3 min的夹尾、5 min的4℃水游泳、5 min的160 Hz水平振荡、24 h的禁食、24 h的禁水、2 min的电击(30 V，电击5 s，间隔5 s)。将上述每种刺激重复3次，形成随机的21次刺激，1次/d，共21 d。正常组大鼠正常饲养。动物在接受刺激的同时灌胃给药，1次/d，连续给药21 d。

1.3 指标检测

1.3.1 体重和糖水消耗 禁水24 h后称重。大鼠单笼饲养1 h，同时每只大鼠供应20 ml 1%蔗糖水，大鼠自由饮水。计算1 h大鼠糖水饮用量(ml)。

1.3.2 开场水平和垂直活动 制备无盖铁皮箱，箱底划有10 cm×10 cm的格子64个。在安静暗室，将大鼠放入箱底中心格子。以大鼠爬行路过的格子数作为水平运动次数，以大鼠后肢直立、前肢悬空或攀爬的次数为垂直运动次数，观察3 min内动物活动情况。

1.3.3 Morris水迷宫 实验开始前先训练大鼠，将其引导至站台。实验时将大鼠放入水池的任一位置，利用Any-maze行为分析软件获取游泳时间、游泳距离、游泳速度、近站台区游泳距离、远站台区游泳距离、近/远站台区距离比、近站台区时间、远站台区时间、近/远站台区时间比等参数。

1.3.4 神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)表达的检测 实验结束后，将大鼠脱颈椎处死，分离海马和额部皮层，甲醛固定，通过免疫组化法检测BDNF和NGF的表达。

1.4 统计学方法 应用SPSS12.0软件行单因素方差分析。

2 结 果

2.1 HY颗粒对PSD大鼠体质量、糖水饮用量、开场水平和垂直活动的影响 PSD组与正常组比较显著减轻大鼠体质量，减少大鼠糖水饮用量；此外，水平活动和垂直运动次数也明显减少(P<0.05)。HY颗粒三个剂量组大鼠体质量、糖水用量、大鼠水平和垂直运动次数与PSD组比较显著增加(P<0.05)。见表1。

组别体质量(g)糖水饮用(ml)水平运动(次)垂直运动(次)正常组212.10±13.0517.00±4.7164.20±30.6913.30±3.65PSD组155.00±12.521)9.00±1.411)14.90±4.201)3.89±1.621)阳性药组187.00±13.622)13.20±4.492)21.50±7.692)8.90±2.332)HY颗粒-Ⅰ组 178.20±19.672)11.60±2.952)25.80±10.272)6.00±2.492)HY颗粒-Ⅱ组 197.50±12.472)13.50±3.242)32.40±11.642)8.30±3.062)HY颗粒-Ⅲ组 204.40±11.352)15.20±5.902)45.00±18.802)10.20±3.162)

与正常组比较：1)P<0.05；与PSD组比较：2)P<0.05；下表同

2.2 HY颗粒对PSD大鼠Morris水迷宫实验的影响 PSD组大鼠游泳距离、近站台区游泳距离、远站台区游泳距离、游泳时间、近站台区时间、远站台区时间与正常组比较显著增加，近/远站台区游泳距离比、近/远站台区时间比显著减少(P<0.05)。HY颗粒三个剂量组近站台区游泳距离、远站台区游泳距离、游泳时间、近站台区时间、远站台区时间与PSD组比较显著缩短，同时近/远站台区游泳距离比、近/远站台区时间比明显增加(P<0.05，0.01)。见表2。

组别游泳距离(m)游泳速度(m/s)近站台区游泳距离(m)远站台区游泳距离(m)近/远站台区距离比游泳时间(s)近站台区时间(s)远站台区时间(s)近/远站台区时间比正常组3.16±2.360.24±0.091.75±1.411.41±0.991.44±0.9113.99±11.986.95±5.967.04±6.321.22±0.70PSD组22.88±5.541)0.25±0.068.72±2.741)14.17±3.331)0.62±0.171)100.64±46.291)37.62±23.001)63.02±26.071)0.61±0.241)阳性药组10.04±10.312)0.25±0.084.88±5.382)5.16±4.972)1.09±0.672)45.73±48.132)21.57±24.3924.16±24.542)0.99±0.512)HY颗粒-Ⅰ组11.26±4.032)0.25±0.105.26±2.222)6.01±1.912)0.86±0.172)50.36±23.512)23.03±11.3227.33±14.542)0.92±0.362)HY颗粒-Ⅱ组9.81±3.742)0.23±0.034.52±2.122)5.29±2.012)0.89±0.292)43.73±18.312)19.77±7.842)23.96±12.762)0.99±0.442)HY颗粒-Ⅲ组8.31±4.702)0.27±0.084.10±2.872)4.22±2.102)0.95±0.322)30.10±17.512)14.67±8.802)15.43±9.112)0.95±0.202)

2.3 HY颗粒对PSD大鼠BDNF和NGF在额叶皮层和海马表达的影响 PSD组大鼠可见海马和额叶皮层BDNF和NGF的表达与正常组比较显著减少(P<0.05)。HY颗粒三个剂量组这两个脑区NGF的表达与PSD组比较均显著增加(P<0.05，0.01)；HY颗粒Ⅱ组和Ⅲ组与PSD组比较还可增加这两个脑区BDNF的表达(P<0.05)。见表3。

组别BDNF皮层(额叶)海马NGF皮层(额叶)海马正常组3.22±0.812.57±0.783.36±1.253.48±0.43PSD组1.86±0.581)1.56±0.431)1.25±0.461)1.41±0.561)阳性药组2.65±0.772)2.18±0.352)2.26±0.812)2.39±0.762)HY颗粒-Ⅰ组2.27±0.521.83±0.512.08±0.652)2.26±0.882)HY颗粒-Ⅱ组2.63±0.582)2.12±0.602)2.28±0.712)2.37±0.542)HY颗粒-Ⅲ组2.90±0.762)2.41±0.632)2.36±0.392)2.54±0.492)

3 讨 论

额叶区域的皮层脑组织约占整个大脑皮质的40%，占有较大的面积，其功能主要是对外界环境来源的各种刺激信号进行整合，并引发机体产生相应的情绪反应。显然，额叶皮层的病理改变，往往除了导致患者认知能力和判断水平，还可能发生行为、情绪和情感障碍。Parikh等〔5〕对103例PSD患者进行1～2年的随访，发现PSD的病情发展和预后与额叶皮层区域的病变程度呈正相关，进一步验证了额叶区皮层组织与PSD的密切联系。颞叶内侧的海马与学习、记忆和情感的联系也已被广泛认可，亦被认为是引起认知障碍的主要区域。陈宇等〔6〕对PSD患者的海马体积进行MRI检测，结果显示梗死后海马组织可见体积的显著萎缩。另外，Huang等〔7〕利用影像学技术进一步证实PSD患者的海马组织还存在代谢障碍。以上资料显然，海马和额叶皮层区域神经元病变的发生及严重程度与PSD的发生、发展和转归均有着密切联系。BDNF和NGF是重要的神经营养多肽，在神经元发育、成熟和分化中均有重要作用，也是评价神经元功能的重要指标〔8〕。神经元损伤往往引发这两种多肽的表达降低，而这种降低又反过来进一步加重神经元损伤。但通过有效治疗后，伴随着症状的改善，BDNF和NGF含量也可显著升高，接近正常水平〔9〕。

传统医学认为，PSD属“中风”和“郁证”的合病。《临证指南医案》提出郁证的病因病机为“因郁则气滞，气滞久则必化火热。热则津液耗而不流，升降之机失度，初伤气分，久必血分，延及郁劳沉疴”。此外，《医学论·越鞠丸》记载：“凡郁病必先气病，气得疏通，则何郁之有?”，显然，传统医学认为PSD的病因是气血逆乱于脑所致。而对其病机的理解则是情志不舒，气机失调，肝气郁结，气滞血瘀，心失所养。针对这一病机研制的HY颗粒具有活血化瘀、开窍理气、疏肝解郁之效。方中丹参活血养血，石菖蒲醒脑开窍为君。“血中气药”川芎活血行气；柴胡条达肝气，疏解肝郁；广郁金活血止痛，行气解郁，清心凉血；伏神宁心安神，共为臣药。佐以香附、枳壳、青皮行气开郁，红花、桃仁活血化瘀，当归活血、养肝、生血，竹茹宁心除烦，以达活血养血、疏肝解郁除烦之功。冰片性善走窜开窍，无往不达，芳香之气，能辟一切邪恶，辛热之性，能散一切风湿。在前期研究中发现，冰片具有促进药物脑内分布的作用，尤其对海马区较为明显，这可能也是该复方能显著改善PSD患者认知能力低下的机制之一〔10〕。甘草则疏理肝气，调和诸药，共为佐使。诸药合用，共起活血化瘀、开窍理气、疏肝解郁之效。

综上所述，HY颗粒能明显改善PSD大鼠行为学异常以及糖水摄入水平，增强大鼠的空间学习和记忆能力以及对未知空间的探究兴趣。此外，增加海马和额叶皮层区域内BDNF和NGF的表达可能是该颗粒抗PSD的机制之一。

1 de Man-vanGinkel JM，Hafsteinsdottir TB，Lindeman E，etal.In-hospital risk prediction for post-stroke depression development and validation of the Post-stroke Depression Prediction Scale〔J〕.Stroke，2013；44(9)：2441-5.

2 丁建红，李 璐，程 妍.个性化心理干预护理对脑卒中后抑郁患者生存质量的影响〔J〕.中国老年学杂志，2015；35(12)：3436-7.

3 Kim YR，Kim HN，Pak ME，etal.Studies on the animal model of post-stroke depression and application of antipsychotic aripiprazole〔J〕.Behav Brain Res，2015；287(3)：294-303.

4 喻 斌，阮 鸣，孙 永，等.电针对抑郁大鼠大脑皮层ATP结合盒式蛋白表达的影响〔J〕.针刺研究，2013；38(4)：286-90.

5 Parikh M，Lipsey J，Robinson R.Two-year longitudinal study of post-stroke mood disorders：Dynamic changes in correlates of depression at one and two years〔J〕.Stroke，1987；18(3)：579-84.

6 陈 宇，徐坚民，冯敢生，等.脑梗死后抑郁症患者海马及杏仁核体积的MRI 研究〔J〕.放射学实践，2009；24(6)：603-6.

7 Huang Y，Chen W，Li Y，etal.Effects of antidepressant treatment on N-acetyl aspartate and choline levels in the hippocampus and thalami of post-stroke depression patients：a study using (1)H magnetic resonance spectroscopy〔J〕.Psychiatry Res，2010；182(1)：48-52.

8 喻 斌，张臻年，杨 丽，等.消郁颗粒对抑郁大鼠的改善作用及机制〔J〕.中国老年学杂志，2016；36(1)：10-2.

9 Pang C，Cao L，Wu F，etal.The effect of trans-resveratrol on post-stroke depression via regulation of hypothalamus-pituitary-adrenal axis〔J〕.Neuropharmacology,2015;97(5):447-56.

10 喻 斌，阮 鸣，董小平，等.不同间隔时间冰片处理对大鼠栀子苷脑靶效应的影响〔J〕.中国药理学通报，2012；28(6)：862-6.

〔2016-01-19修回〕

(编辑 袁左鸣)

The effect and mechanism of Huayu Kaiqiao Jieyu therapy on post-stroke depression

YU Bin, ZHANG Zhen-Nian, HUANG Shi-Wen,et al.

Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, Jiangsu, China

Objective To research the improvement and mechanism of Huayu Kaiqiao Jieyu granules on post-stroke depression (PSD)rats.Methods The behavior of depressive rats, which were formed by MCAO combining with chronic stress, were detected by Morris water maze, syrup consuming and Open-field experiments. Moreover, the expressions of NGF and BDNF in frontal cortex and hippocampus were measured to explore its mechanism.Results Comparing with those of model group, Huayu Kaiqiao Jieyu granules increased the body weight and syrup consuming obviously, improved open-field behaviors, shortened the total swim route, latency, time consuming and route of swimming in distant and nearby area, enhanced time consuming ratio and route ratio of swimming in nearby and distant area(P<0.05, 0.01). Moreover, this granules increased the expressions of NGF and BDNF in frontal cortex and hippocampus markedly (P<0.05, 0.01).Conclusions The granules improves PSD disorder and the mechanisms is involved with increasing the expressions of NGF and BDNF in frontal cortex and hippocampus.

Huayu Kaiqiao Jieyu granules; Post-stroke depression

国家自然科学基金资助项目(81573713，81001651);江苏省基础研究计划(BK20151564);江苏省大学生创新性实践训练计划

1 南京市中医院脑病科 2 贵州医科大学药学院

程海波(1975-)，男，副教授，博士，主要从事中医药方剂研究。 沈祥春(1973-)，男，教授，博士，主要从事民族药物研究。

喻 斌(1978-)，男，副教授，博士，主要从事中药药理学研究。

R749

A

1005-9202(2016)23-5771-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.23.002