儿童喉乳头状瘤组织中TLR4、NF-κB蛋白表达及相关性研究

胡彬雅 赵斯君 任基浩 陶礼华 田道法

儿童喉乳头状瘤组织中TLR4、NF-κB蛋白表达及相关性研究

胡彬雅1赵斯君1任基浩2陶礼华1田道法3

目的 研究儿童喉乳头状瘤(larynx papilloma，LP)，Toll样受体4（Toll-like receptor4,TLR4）、核转录因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)蛋白的表达及其相互关系。方法 应用免疫组化法检测42例LP组织中TLR4和NF-κB蛋白的表达情况，分析两者表达的相关性。结果 免疫组化结果显示42例儿童喉LP组织中TLR4阳性表达率为76.19%,明显高于声带息肉组(P<0.01)和正常黏膜组(P<0.01)；42例LP组织中NF-κB阳性表达率为78.57%,显著高于儿童声带息肉组和正常喉黏膜组(P<0.01);对同一组织标本连续性切片观察发现TLR4与NF-κB蛋白表达的区域分布有呈明显重叠，进而采用Spearman双变量相关性分析显示喉乳头状瘤组织中TLR4与NF-κB蛋白表达水平呈高度正相关（r=0.623，P0.001）。结论 TLR4和NF-κB均在LP组织中高表达，可能在LP的发生发展过程中起着重要作用。

喉乳头状瘤;TLR4;NF-κB;

喉乳头状瘤（laryngeal papilloma，LP）在临床上比较常见,虽然在组织学上属于良性肿瘤,但是有复发、恶变的潜在危险,近年来LP的发病有明显增高的趋势,但其易于复发的原因不清。在促进肿瘤的发生和演进中,慢性感染和炎症被认为是最重要的后天性和环境因素,而其中Toll样受体 (Toll-like receptors,TLRs)介导的信号传导通路可能起到重要作用[1]。TLR4是目前发现与肿瘤发病关系最密切的TLRs家族成员之一，TLR4活化的信号传导属于经典的Toll样信号通路,可以启动NF-κB途径和应激激酶途径(stress kinase pathway),最终导致炎症反应[2]。但TLR4和NF-κB在LP组织中是否表达和具有相关性,及其在LP的发病中是否起作用尚有待研究。本研究应用免疫组织化学方法检测TLR4和NF-κB在儿童LP组织、声带息肉及正常的喉黏膜组织中的表达情况，并分析两者的相互关系，以进一步探讨它们在儿童LP形成、发展中的作用机制。

材料与方法

1 材料

选择湖南省儿童医院2010年9月～2015年9月期间行手术治疗并经病理检查证实的儿童LP患儿42例。其中男性17例，女性25例，年龄2～7岁，平均3.6±1.5岁。另选择同期25例声带息肉患儿病理标本和25例正常喉黏膜组织作为对照。正常对照组标本来源于因为喉癌而行全喉切除术的喉体标本，石蜡切片HE染色后显微镜下观察证实没有发现癌细胞。所有标本均经过10ml/L的福尔马林固定，石蜡包埋，4μm层厚连续切片。

2 方法

兔抗人TLR4多克隆抗体和兔抗人NF-κB多克隆抗体（活化型）均为北京中杉金桥生物科技公司产品，SP试剂盒由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。切片常规脱蜡，梯度乙醇脱水，微波抗原修复，内源性过氧化物酶阻断15min，分别滴加TLR4多克隆抗体（1∶100）和NF-κB的多克隆抗体（1∶100），置27℃孵育60min，二抗于37℃孵育30min,三抗37℃孵育30min，DAB显色4～8min，苏木精复染后，脱水、透明、封固后光镜下观察。用已知的阳性切片染色作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。将染色强度和阳性细胞数结合判断TLR4和NF-κB免疫组化染色结果。先按染色强度打分：0分为无色，1分为浅黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色，染色强度需与背景着色相对比;再按阳性细胞所占百分比打分：0分为阴性，1分为阳性细胞≤10%，分为11%～30%，3分为31%～70%，4分为>71%，染色强度与阳性细胞百分比的乘积>3分为免疫反应阳性(+)[3]。

3 统计学分析

数据处理运用SPSS 11.0统计软件包，率的比较采用两样本构成比（率）比较的χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义；TLR4和NF-κB表达相关性检验用Spearman相关分析，检验水准α=0.05。

结果

1 三组间TLR4和NF-κB的表达情况比较

TLR4表达主要表现为细胞质和(或)细胞膜有棕黄色或棕褐色颗粒沉淀。42例儿童LP组织中有32例TLR4为阳性表达，阳性率为76.19%，明显高于儿童声带息肉组（P<0.01，表1）和正常对照组（P< 0.01，表1）；而儿童声带息肉组和正常对照组比较差异无统计学意义。

NF-κB表达主要表现为细胞核和细胞质中有棕褐色或棕黄色颗粒沉淀。42例LP组织中有33例阳性，阳性表达率为78.57%，与儿童声带息肉组和正常对照组两组比较差异均有统计学意义（P<0.01，表1）；而儿童声带息肉组和正常对照组的NF-κB阳性率比较差异无统计学意义。

表1 TLR4、NF-κB在三组中的阳性表达情况[n(%)]

2 儿童喉乳头状瘤组中TLR4和NF-κB表达关系分析

免疫组化结果显示儿童LP组织中TLR4阳性表达率为76.19%，NF-κB阳性表达率为78.57%，对同一组织标本连续性切片观察发现TLR4与NF-κB蛋白表达的区域分布有呈明显重叠，进而采用Spearman双变量相关性分析显示LP组织中TLR4与NF-κB蛋白表达水平呈高度正相关（r=0.623，P＜0.001）。

讨论

Toll样受体自发现以来，作为连接天然免疫和获得性免疫系统的重要桥梁，在免疫系统中有着极为特殊的地位。近来的部分研究表明，它在肿瘤的发生发展可能有着较为重要的作用。首先，从肿瘤的“危险模式”理论来看，肿瘤组织生长侵袭转移过程中可降解细胞外基质，产生活性氧物质和某些应激保护性因子(如HSP)，以及细胞坏死，所有的这些因素包括肿瘤抗原都为“危险因子”并可以成为TLR的内源性配体，从而激活TLR信号途径，促进APC的成熟(与其他免疫相关分子共同作用)，进而活化T细胞引起特异性抗肿瘤免疫；另一方面，如果肿瘤无法产生足够的内源性配体，如在肿瘤的早期，或肿瘤细胞因缺乏足够血供发生凋亡而不是能产生危险信号的坏死等因素，TLRs信号途径不能有效的激活或者TLRs的表达下调，则可能出现肿瘤的免疫耐受或免疫逃逸。近来在肺癌、喉癌的研究中发现，Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)在癌细胞或浸润炎症细胞上的表达可能与肿瘤的免疫逃逸密切相关。而TLR4信号途径的持续激活在某些研究中被认为是慢性炎症持续存在进而发展为肿瘤的重要原因[2]。TLR4是发现最早的Toll样受体家族的重要成员之一,是有效识别革兰阴性菌脂多糖(lipopolysacchide,LPS)的关键受体,通过识别病原体成分及其介导的信号转导通路,在天然免疫中发挥着重要作用。核转录因子-κB(nuclear factorkappa B,NF-κB)是广泛存在于哺乳动物细胞中的一种重要的转录调控因子,能与多种基因启动子中含有的κB序列结合,发挥转录因子作用,激活多种与细胞生长或凋亡相关的细胞因子转录。许多肿瘤细胞株及肿瘤组织中也发现有NF-κB的高表达与持续性激活。我们的研究发现TLR4在儿童LP组的阳性率显著高于儿童声带息肉组和正常喉黏膜组。提示TLR4、NF-κB在儿童LP组织中的高表达，在儿童LP组织的发生发展中可能起重要的作用。

近年来一些研究发现,多种肿瘤细胞表面表达TLR4,后者通过对病原相关分子模式PAMPs进行模式识别,经一系列信号转导分子最终激活NF-κB,刺激细胞增殖和转化,抑制凋亡并导致炎性反应因子大量释放,致使肿瘤微环境形成,从而促进肿瘤的发生和发展。TLR4主要表达于免疫细胞尤其是巨噬细胞和树突状细胞表面,在气管上皮细胞上也有表达。TLR4过TLR4信号通路激活NF-κB,诱导炎性反应细胞因子大量释放,导致肿瘤微环境形成,从而促进肿瘤的侵袭和进展[4]。TLR4-MyD88-NF-κB信号通路激活,可活化NF-κB转位入细胞核,导致促炎细胞因子IL-6和促肿瘤生长因子TNF-α等大量分泌,最终促肿瘤细胞的生长和抵抗抗肿瘤药物紫杉醇诱导的肿瘤细胞凋亡[5]。有研究表明TLR4/MyD88信号通路可能是机体内与患者的不良预后密切相关的机制之一[6]。本研究显示，TLR4与NF-κB表达在LP组织中具有显著正相性，提示该信号传导通路激活且导致下游炎症因子的释放可能是喉乳头状瘤发生发展的机制之一，但其具体分子靶点尚有待于进一步深入研究。

1 Chen R,Alvero AB,Silasi DA.Inflammation,cancer and chemoresistance:taking advantage of the toll-like receptor signaling pathway.Am J Reprod Immunol.2007,57(2): 93-107.

2 HUANG B,ZHAO J,UNKELESS J C,et al.TLR signaling by tumor and immune cells:a double edged sword[J].Oncogene,2008,27(2):218-224.

3 Wang JX,Zheng S.caspase-3 and survivin expression in pediatricn eumblastoma and their roles in apoptosis[J]. Chin M ed J(Eng1),2004,117(12):1821-1824.

4 Semlali A,Reddy ParineN,Arafah M,et al.Expression and Polymorphism of Toll-Like Receptor 4 and Effect on NF-κB Mediated Inflammation in ColonCancer Patients. PLoS One.2016,11(1):1-19.

5 Ran S.The Role of TLR4 in Chemotherapy-Driven Metastasis.Cancer Res.2015,75(12):2405-2410.

6 Kim KH,Jo MS,Suh DS,Expression and significance of the TLR4/MyD88 signaling pathway in ovarian epithelial cancers.World J Surg Oncol.World Journal of Surgical Oncology 2012,10:193-2000.

（收稿:2016-09-18）

Correlation of the expression of TLR4 and NF-κB proteins in juvenile laryngeal papilloma

HU Binya,ZHAO Sijun,REN Jihao,ZHU Yimin,TIAN Daofa
Departmento of Otorhinolaryngology,Hunan child’hospital,Changsha,Hunan,China,410007

Objective To investigate correlation between the expression of TLR4 and NF-κB proteins in juvenile laryngeal papilloma.Methods The expression of TLR4 and NF-κB proteins were detected ith immunohisto chemial method in 42 cases of juvenile laryngeal papilloma，Analysis of the correlation of the expression.Results The positive rates of TLR4 protein in juvenile laryngeal papilloma were 76.19%and higher than that in polyp of vocal cord(P<0.01)and the normal laryngeal moeusa(P<0.01). And the NF-κB protein positive rate was 78.57%in juvenile laryngeal papilloma and higher than that in polyp of vocal cord and the normal laryngeal mucosa(P<0.01).On the same tissue samples continuity slice observation found that TLR4 and nf-kappa B protein expression of regional distribution has obvious overlap，Then use Spearman bivariate correlation analysis showed that there was a significant positive correlation between the expression of TLR4 and NF-κB in juvenile laryngeal papilloma.Conclusion The abnormal expression of TLR4 and NF-κB may play important role in the pathogenesis of juvenile laryngeal papilloma.

Juvenile laryngealpapilloma;Toll-like receptor4;nuclear factor-kappa B

10.16542/j.cnki.issn.1007-4856.2016.05.005

1湖南省儿童医院耳鼻咽喉科（长沙，410007）

2中南大学湘雅二医院耳鼻咽喉头颈外科（长沙）

3湖南中医药大学耳鼻咽喉科（长沙）

胡彬雅，副主任医师.Email:zhzi628@126.com