绿色杜氏藻类胡萝卜素异构酶(CRTISO)的基因生物信息学与转录差异研究

周丽亚，龚一富，朱帅旗，王何瑜

(宁波大学 海洋学院，宁波 315211 )



绿色杜氏藻类胡萝卜素异构酶(CRTISO)的基因生物信息学与转录差异研究

周丽亚，龚一富，朱帅旗，王何瑜

(宁波大学 海洋学院，宁波 315211 )

类胡萝卜素异构酶(Carotenoid isomerase,CRTISO)是类胡萝卜素生物合成途径中催化番茄红素由顺式结构向反式结构转变的关键异构酶。利用转录组测序获得绿色杜氏藻crtisocDNA全长序列，进行生物信息学分析，并研究乙酰水杨酸(ASA)、花生四烯酸(AA)处理绿色杜氏藻后该基因转录差异与类胡萝卜素含量变化情况。生物信息学结果表明：绿色杜氏藻crtisocDNA全长1176 bp，开放阅读框(ORF)长度为795 bp，编码264个氨基酸。该蛋白质的理论相对分子质量为29 522.6，理论等电点(PI)为5.86，该蛋白为稳定蛋白与亲水性蛋白，无信号肽和跨膜区域，定位于细胞质基质。氨基酸序列同源性比对结果表明其与小球藻的类胡萝卜素异构酶同源性最高，达到78%。RT-qPCR结果表明，AA、ASA诱导后，该基因表达量均呈现先升高后降低的趋势，且当AA、ASA质量浓度分别为62.5 mg/L、50 mg/L时表达量最高。类胡萝卜素含量大致呈现逐渐升高的趋势。当AA、ASA质量浓度分别为312.5 mg/L、100 mg/L时，类胡萝卜素含量达到最高。即该基因与类胡萝卜素含量呈一定相关性。

绿色杜氏藻；crtiso；生物信息学分析；类胡萝卜素

绿色杜氏藻(Dunaliellaviridis)属于绿藻门、杜氏藻科、杜氏藻属，是一类无细胞壁的单细胞绿藻[1]，含有丰富的类胡萝卜素。类胡萝卜素是由异戊二烯骨架构成的萜类物质，广泛存在于动物、植物、真菌、藻类中[2]。在类胡萝卜素合成途径中，经Zeta-胡萝卜素脱氢酶与八氢番茄红素脱氢酶的脱氢作用下产生的番茄红素为顺式结构，但合成α-胡萝卜素和β-胡萝卜素需要反式结构的番茄红素，类胡萝卜素异构酶(Carotenoid isomerase,crtiso)即是催化番茄红素由顺式结构转变为反式结构的关键异构酶[3]。目前人们对高等植物中crtiso的功能和作用了解取得较大进展，Kato等[4]研究表明，柑橘中crtiso的表达下调使果实中β-胡萝卜素含量提高，证实了该基因表达量与β-胡萝卜素的代谢有关。李群睿等[5]研究表明，crtiso的表达可以促进玉米种子胚乳中类胡萝卜素的积累。史艳梅等[6]研究认为，crtiso表达量降低抑制了胡萝卜素降解反应的进行，可能会导致烟草中胡萝卜素的积累。但在藻类中关于该基因的功能和作用研究甚少，因此研究其在绿色杜氏藻类胡萝卜素合成代谢途径中的作用具有重要意义。

乙酰水杨酸(acetylsalicylic acid,ASA)、花生四烯酸(arachidonic acid,AA)是植物细胞培养中普遍使用的诱导子，对提高植物次生代谢产物有着重要作用。王丽丽等[7]研究发现，适宜浓度的花生四烯酸可以提高雨生红球藻中虾青素的含量。王鑫威等[8]研究发现，诱导子甲基茉莉酸(MeJA)作用下的雨生红球藻虾青素含量和dxs表达量呈正相关。因ASA、AA等与MeJA都属于生物类诱导子，我们推测ASA与AA也可通过调节crtiso的表达量从而对绿色杜氏藻类胡萝卜素含量产生影响[9]。

目前，crtiso已在番茄[10]、光合蓝细菌(Synechocystis6803)[11-12]、玉米[13]与拟南芥[14]中被克隆，但在绿色杜氏藻中还未见报道。本研究从绿色杜氏藻转录组测序中获得crtisocDNA全长序列，利用乙酰水杨酸、花生四烯酸处理绿色杜氏藻，研究该基因转录量差异及类胡萝卜素含量变化[15]。

1 材料与方法

1.1 藻种的获得与处理

绿色杜氏藻藻种来源于宁波大学海洋生物工程重点实验室微藻室。将绿色杜氏藻细胞以1×105cells/mL接种到PKS培养基(pH 7.5)中，培养基配方参照朱颖[16]等，培养条件为(25±0.5)℃，62.5 μmol photons/(m2·s)，光暗周期比12 h：12 h，每天摇瓶2～3次。培养2 d后，用不同浓度的ASA和AA处理藻体，AA浓度分别为0、0.5、2.5、12.5、62.5和312.5 mg/L；ASA浓度分别为0、10、25、50和100 mg/L，每个浓度设3个平行。

1.2 绿色杜氏藻crtiso序列的获得

基因组测序取对数生长期的绿色杜氏藻，4 ℃，5000 r/min，10 min收集藻细胞，按照Takara RNAiso Plus Kit(Takara，大连)操作说明书提取总RNA，-20℃保存。将总RNA进行转录组测序，通过分析获得crtisocDNA全长序列[15,17]。

1.3 绿色杜氏藻CRTISO蛋白的生物信息学分析

将测序得到的核苷酸序列和氨基酸序列在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站上查找其开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)[18]，并进行核酸、氨基酸比对。通过ExPASy(http://expasy.org/tools)网站预测蛋白二级结构、三级结构、等电点、相对分子质量等[19]。利用Vector NTI 7.1软件推导CRTISO氨基酸序列；用Vector NTI 7.1 软件对测序获得的绿色杜氏藻crtiso进行多序列比对；用ClustalX 1.81和MEGA 6.0软件对绿色杜氏藻蛋白绘制系统进化树(NJ法)。通过CBS (http://www.cbs.dtu.dk/)与predictprotein (https://www.predictprotein.org/)网站预测信号肽、转运肽及其跨膜结构域[20-23]。

1.4 绿色杜氏藻crtiso表达调控研究

将绿色杜氏藻细胞以1×105cells/mL接种到培养基中，培养2 d后，用不同浓度的ASA和AA处理藻体。ASA浓度分别为0、10、25、50和100 mg/L；AA浓度分别为0、0.5、2.5、12.5、62.5和312.5 mg/L，设3个平行，处理24 h后，取80 mL藻液，4 ℃，5000 r/min，10 min收集藻细胞，提取RNA用于定量PCR分析，根据Takara反转录试剂盒将提取的RNA反转录获得cDNA。以β-actin为参照，设计定量引物序列为β-actinF：5′-CGTGACTTGACGGACTACCTG-3′，β-actinR：5′-TAGTTTTTGTCCAGAGCCGAG-3′。根据本实验获得的绿色杜氏藻crtisocDNA序列，合成定量引物，上游引物序列：5′-TGGATGCCAGGGAGTATG-3′；下游引物序列：5′-GTTCAAGAAACGGCGATG-3′。本实验引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。反应体系为：SYBR®PremixExTaqTM(2×)10 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 6.4 μL。反应程序为：94 ℃预变性3 min；40个循环扩增(94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s)；72 ℃再延伸10 min，16 ℃保存。用2-ΔΔCt方法对不同处理的绿色杜氏藻crtiso转录水平进行数据分析[24]。使用t检验，检验水平α=0.05，若P<0.05，则表明有显著差异；若P<0.01，则表明有极显著差异。

1.5 绿色杜氏藻类胡萝卜素含量的测定

用不同浓度ASA、AA处理绿色杜氏藻，培养至对数期，吸取20 mL藻液置于50 mL离心管中，4 ℃，4000 r/min 离心10 min ，用双蒸水冲洗沉淀2 次，加16 mL 80%丙酮，冰浴超声5 min，-20 ℃保存24 h后，8000 r/min 离心10 min，取上清。利用722型分光光度计(上海元析仪器有限公司)测定提取液在波长470、646、663 nm处的吸光度。类胡萝卜素含量计算根据Jensen公式[16]。

2 结果与分析

2.1 绿色杜氏藻crtiso序列分析

通过绿色杜氏藻转录组测序获得了crtisocDNA序列(GeneBank Accession number：KT751176)，对其进行核苷酸序列分析，结果表明，该cDNA全长为1176 bp，开放阅读框(ORF)为795 bp(核苷酸21 bp～815 bp)，共编码264个氨基酸(图1)。

图1 绿色杜氏藻crtiso cDNA全长及其推导的氨基酸序列

注：矩形框代表起始密码子；矩形框带“*”代表终止密码子；下划线部分为保守序列

2.2 绿色杜氏藻CRTISO蛋白的理化性质分析

利用ProtParam (http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam)在线软件对绿色杜氏藻CRTISO蛋白的氨基酸序列基本特征进行分析，结果表明，绿色杜氏藻CRTISO蛋白的分子式为C1310H2031N371O381S14，原子个数为4107，相对分子质量为29 522.6，理论等电点为5.86。该蛋白中Gly最多，占9.8%，Gln最少，不含吡咯赖氨酸(Ply)与硒半胱氨酸(Sec)。该蛋白中正电荷残基(Arg+Lys)总数为32，负电荷残基(Asp+Glu)总数为37，预测不稳定指数为30.09，脂肪系数为75.34，推测该蛋白质分类为稳定蛋白。通过在线软件ProtScale (http://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/)对绿色杜氏藻CRTISO蛋白编码的氨基酸序列的疏水性/亲水性进行预测(图2)，结果显示，第139位Arg亲水性最强，其分值最低为-3.567；第102位Leu分值最高达到2.189，说明其疏水性最强。总的平均亲水性平均系数为-0.318，预测绿色杜氏藻CRTISO蛋白为亲水性蛋白。使用CBS (http://www.cbs.dtu.dk/services)与Predictprotein (https://www.predictprotein.org)在线软件对绿色杜氏藻CRTISO蛋白进行亚细胞定位预测并进行综合分析，预测结果显示，绿色杜氏藻CRTISO蛋白不含信号肽，也不存在跨膜区域，定位于细胞质基质。

图2 绿色杜氏藻CRTISO氨基酸亲水性/疏水性预测图

2.3 绿色杜氏藻CRTISO蛋白结构预测

用SOPMA (https://sopma.expasy.org/)软件预测绿色杜氏藻CRTISO蛋白二级结构，结果表明，绿色杜氏藻CRTISO蛋白中无规则卷曲所占比例最高，约占37.88%，α-螺旋约占29.92%，延长链与β-转角所占比例最低，分别只有20.45%和11.74%。绿色杜氏藻CRTISO蛋白三级结构预测结果表明(图 3)，绿色杜氏藻CRTISO蛋白存在两个保守序列，分别是A位SNATRWDTF (28 aa～36 aa)和B位GLYCVGDSC(T/A)FPGQG (208 aa～221 aa)。保守序列参与NAD(P)绑定，其中位于B位的GQG中的两个甘氨酸可能与NAD(P)结合，有利于促进α-螺旋紧密堆积在β-折叠附近，且对特异性反应具有催化作用。

图3 绿色杜氏藻CRTISO蛋白三级结构预测图

注：图中框内为保守序列，其中A为SNATRWDTF，B为GLYCVGDSC(T/A)FPGQG。①为α-螺旋；②为无规则卷曲；③为β-折叠

2.4 绿色杜氏藻CRTISO蛋白系统进化树分析

通过NCBI数据库中Blast P (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对其他物种CRTISO氨基酸序列进行相似性搜素和比对，随机选取10个物种。利用ClustalX 1.81 和 MEGA6.0软件对11个不同物种的CRTISO构建进化树，所用序列有，绿色杜氏藻(Dunaliellaviridis，GeneBank Accession number KT751176)、小球藻(Chlorellavariabilis，GeneBank Accession number XP_005843230.1)、胶球藻(CoccomyxasubellipsoideaC-169，XP_005650388.1)、衣藻(Chlamydomonasreinhardtii，GeneBank Accession number XP_001698231.1)、青色球形斯塔尼尔氏菌(StanieriacyanosphaeraPCC7437，GeneBank Accession number WP_015193360.1)、蓝藻(Cyanothecesp.PCC7822，GeneBank Accession number WP_013322256.1)、葡萄(Vitisvinifera，GeneBank Accession number CBI39106.3)、小立碗藓(Physcomitrellapatens，GeneBank Accession number XP_001776776.1)、江南卷柏(Selaginellamoellendorffii，GeneBank Accession number XP_002975224.1)、小果油茶(Crinaliumepipsammum，GeneBank Accession number WP_041226947.1)、番茄(Solanumlycopersicum，GeneBank Accession number XP_004249387.1)。进化树分析结果表明(图4)，11个不同物种CRTISO氨基酸总体分为3支，分别为藻类分支、微生物分支和植物分支。绿色杜氏藻与衣藻、胶球藻与小球藻同属藻类，聚类为1支，表明本研究克隆的CRTISO蛋白属于藻类CRTISO家族，绿色杜氏藻与其他3种藻类亲缘关系较近。

2.5 诱导子对绿色杜氏藻类胡萝卜素含量和crtiso表达影响

研究不同浓度ASA处理对绿色杜氏藻类胡萝卜素含量的影响，结果表明(图5-A)，随着ASA浓度的增加，绿色杜氏藻类胡萝卜素含量呈现逐渐升高的趋势。ASA处理组(10～100 mg/L)的类胡萝卜素含量显著高于对照组，说明ASA可促进绿色杜氏藻类胡萝卜素的生物学合成。RT-qPCR分析结果表明(图6-A)，ASA处理组也显著促进了绿色杜氏藻crtiso的表达，说明ASA促进绿色杜氏藻类胡萝卜素合成可能是通过促进crtiso的表达来实现的。

图4 绿色杜氏藻CRTISO氨基酸系统进化树

注：矩形框为绿色杜氏藻

研究不同浓度AA处理对绿色杜氏藻类胡萝卜素含量的影响，结果表明(图5-B)，随着AA浓度的增加，绿色杜氏藻类胡萝卜素含量呈现逐渐升高的趋势。AA浓度为62.5～312.5 mg/L时，绿色杜氏藻类胡萝卜素含量最高，RT-PCR结果也表明(图6-B)，该在浓度范围内，绿色杜氏藻crtiso表达也显著高于对照组，绿色杜氏藻crtiso表达与类胡萝卜素含量之间存在一定的线性关系，说明绿色杜氏藻类胡萝卜素的生物合成可能是通过crtiso的表达来实现的。

图5 不同浓度ASA、AA对绿色杜氏藻类胡萝卜素含量的影响

注：A为ASA; B为AA。*表示差异显著(P<0.05)；**表示差异极显著(P<0.01)

图6 不同浓度ASA、AA处理的绿色杜氏藻crtiso表达量差异

注：A为ASA；B为AA。*表示差异显著(P<0.05)；**表示差异极显著(P<0.01)

3 讨论

本研究从绿色杜氏藻中获得crtisocDNA全长序列，利用生物信息学对该基因的核酸及氨基酸序列进行分析，并对其结构和功能进行预测。结果显示，绿色杜氏藻crtiso全长为1176 bp，开放阅读框为795 bp，编码264个氨基酸。研究表明绿色杜氏藻CRTISO与烟草CRTISO相似，为亲水性蛋白，无信号肽，具有相似的二级结构，主要为无规则卷曲与α-螺旋，但无规则卷曲与α-螺旋在烟草中所占比例均大于绿色杜氏藻。Zhao等[25]在对水稻CRTISO的研究中发现该蛋白含有两个保守序列：SNATRWDTF、GLYCVGDSC(T/A)FPGQG，在绿色杜氏藻中也发现了相同的保守序列。可推测CRTISO在绿色杜氏藻中的功能与其他陆生植物相同，即催化番茄红素由顺式结构转变为反式结构。

本次RT-qPCR结果表明绿色杜氏藻crtiso表达水平受ASA、AA影响。随着ASA、AA质量浓度增加，crtiso表达水平呈现先升高后降低的趋势。当ASA、AA浓度分别为50 mg/L、62.5 mg/L时，基因表达水平达到最大。姜晶等探讨乙酰水杨酸胁迫下苗期番茄体内蔗糖代谢相关酶活性与基因表达的变化[26]，董霞等[27]研究水杨酸对烟草gprs表达的影响，Gong等[28]研究dxs表达与诱导子乙酰水杨酸、花生四烯酸的相关性。以上研究表明，随着诱导子ASA、AA质量浓度增加，植物次生代谢产物关键基因的表达呈现先上升后下降的趋势，这与绿色杜氏藻crtiso表达情况一致。该结果可能是因为在适宜浓度下，诱导子与植物细胞膜的受体部位结合，细胞的变化产生了一系列生理生化反应，导致植物有关基因表达量提高[29]。但在较高浓度下，次生代谢产物关键基因表达水平降低，一方面可能是由于胁迫的加剧引起植物细胞内生理生化改变，从而降低基因表达量；另一方面，过高浓度的诱导子使植物细胞的生长受到强烈抑制，植物细胞死亡。可以认为crtiso对绿色杜氏藻次生代谢产物的合成有重要的作用。

本实验获得了绿色杜氏藻crtisocDNA全长序列，对其进行全面的生物信息学分析，并研究诱导子ASA、AA作用下绿色杜氏藻crtiso表达与类胡萝卜素含量情况，为今后深入研究CRTISO提供了理论依据。

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Bioinformatics analysis and transcription difference of carotenoid isomerase (CRTISO) gene inDunaliellaviridis

ZHOU Li-ya,GONG Yi-fu，ZHU Shuai-qi,WANG He-yu

(School of Marines Science,Ningbo University,Ningbo 315211,China)

Carotenoid isomerase (CRTISO) is a key enzyme in the pathway of carotenoid,which can catalyze the structure of carotenoids from cis-to trans-.Full length ofcrtisoinDunadiellaviridiswas acquired by RNA-sequencing,then,the sequence was analyzed by several bioinformatics softwares.Transcriptional levels ofD.viridistreated by different concentration of acetylsalicylic acid (ASA) and arachidonic acid (AA) were checked by real-time quantitative PCR.The full cDNA length ofcrtisowas 1176 bp.It contained a 795 bp open reading frame (ORF),encoding 264 amino acids.Relative molecular mass was 29 522.6.Theoretical isoelectric point of the protein was 5.86.It was predicted that the CRTISO inD.viridiswas properly targeted to the cytoplasmic matrix.Compared with amino acid sequences in NCBI database,it was found that the amino acid sequence of CRTISO shared the highest homology withChlorellavariabilis(78%).RT-qPCR showed that the transcription level ofcrtisoreached the maximum when the concentration of AA got 62.5 mg/L and ASA reached 50 mg/L.The result of carotenoid content showed that the carotenoid content reached the maximum when the concentration of AA got 312.5 mg/L and ASA reached 100 mg/L.There was certain correlation between the expression ofcrtisogene and the content of carotenoids.

Dunaliellaviridis; carotenoid isomerase ; bioinformatic; carotenoid

2016-03-10；

2016-04-14

收稿日期：浙江省科技厅重点科技创新团队项目(2012R10029-07，2010R50029)；宁波科技攻关项目(2013C10018)；浙江省大学生科技创新活动计划暨新苗人才计划项目(2014R405050)；宁波大学优秀学位论文培育基金(py2014020)

周丽亚，主要从事藻类生物技术方面的研究，E-mail：2537677553@qq.com

龚一富，副教授，主要从事植物次生代谢产物及机理研究，E-mail: gongyifu@nbu.edu.cn

10.3969/j.issn.2095-1736.2016.06.015

Q558

A

2095-1736(2016)06-0015-05