酿酒酵母生产谷胱甘肽合成酶系发酵条件的研究

董永胜，马蕾，王艳杰

（齐鲁工业大学生物工程学院，山东济南250353）

酿酒酵母生产谷胱甘肽合成酶系发酵条件的研究

董永胜，马蕾，王艳杰

（齐鲁工业大学生物工程学院，山东济南250353）

研究酿酒酵母NJ-16生产谷胱甘肽合成酶系的发酵条件，确定酵母最适产酶条件为：摇床转速180 r/min，pH 5.0，培养温度32℃，培养基中硫酸镁含量为2 g/L。此条件下，酿酒酵母NJ-16的谷胱甘肽合成酶系的活性为12.5U/g湿菌体。

酿酒酵母；谷胱甘肽合成酶系；发酵条件

谷胱甘肽合成酶系是催化L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸生成谷胱甘肽（Glutathione，GSH）的酶，由γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（GSH-Ⅰ）和谷胱甘肽合成酶（GSH-Ⅱ）组成[1-2]。谷胱甘肽具有清除自由基、解毒、延缓衰老、预防糖尿病、保护肝脏、抗辐射、提高人体免疫力、抑制艾滋病病毒、防止皮肤老化等功能[3-4]，在临床医学、运动营养学、食品加工等众多领域具有重要的应用价值和产业前景[5-6]，其工业化生产越来越受到关注。谷胱甘肽作为生物活性物质，已越来越多地应用于食品工业中[7]，如在面制品中能起到强化氨基酸的作用，在肉类和海鲜食品中可强化风味并延长保鲜期，在水果蔬菜类饮料中可有效防止食品褐变，还可用于帮助人们排毒的功能食品的生产[8]。

酵母发酵法是生产谷胱甘肽的主要方法，酵母谷胱甘肽合成酶系的活性对谷胱甘肽的产量有决定性的作用，但正常酵母的酶系活性较低，为提高谷胱甘肽产量，常采用各种育种技术进行生产菌株的选育[9-10]。目前对酵母生产谷胱甘肽的发酵条件有较多的研究[11]，也对酵母在极端条件下合成谷胱甘肽进行了一些研究[12-13]，但对酵母合成谷胱甘肽合成酶系的培养条件研究较少。作者以选育的酿酒酵母NJ-16为出发菌株，以提高酵母谷胱甘肽合成酶系的活性为研究目标，探讨酵母高产谷胱甘肽合成酶系的发酵条件，为提高酵母工业化谷胱甘肽产率提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌种

酿酒酵母（S.cerevisiae）NJ-16：山东省微生物工程重点实验室选育。

1.2 培养基

种子培养基（g/L）：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母膏10，pH 6.0。

发酵培养基（g/L）：葡萄糖30，蛋白胨10，酵母膏5，（NH4）2SO45.0，KH2PO45.0，MgSO42.0，pH 5.0。

1.3 酵母培养

从活化斜面上挑取一环菌体接入到种子培养基中，30℃静置培养24 h。然后将酵母种子培养液以10%的接种量接入到发酵培养基中培养。

1.4 生物量测定

取发酵液25 mL，离心收集菌体，用蒸馏水冲洗3次，离心收集菌体，于70℃烘干至恒重后称重。

1.5 谷胱甘肽合成酶系活性的测定

将发酵液离心收集细胞，用磷酸缓冲液洗涤菌体，离心收集细胞。取1.0 g湿菌体加入到19.6mL的0.03mol/L、pH7.2的磷酸缓冲液中，再加入0.4mL的甲苯，在35℃下处理2 h。离心收集上清液，即得粗酶液。取10.0mL粗酶液加入到10.0mL反应液中，在37℃、150 r/min下反应1 h，反应液再在沸水浴中保温10min。离心取上清液，采用HPLC法测定上清液中谷胱甘肽的含量。谷胱甘肽合成酶系活力单位定义：上述反应条件下，每小时转化生成1mg谷胱甘肽的酶量为1个酶活单位。

反应液组成：40mmol/LL-谷氨酸，20mmol/LL-半胱氨酸，20mmol/L甘氨酸，20mmol/LMgC12，200mmol/L磷酸缓冲液（pH 7.0）。

2 结果与讨论

2.1 温度对酵母合成谷胱甘肽合成酶系的影响

将酵母接种于发酵培养基中，于160 r/min下培养20 h，温度分别控制在26、28、30、32、34、36、38℃，结果如图1所示。

图1 不同培养温度下酵母谷胱甘肽合成酶系活性和生物量的变化Fig.1 Changesof theglutathionesynthetasesactivity in the S. cerevisiae cellsand biom asscultured under different tem perature

由图1可知，发酵温度对谷胱甘肽合成酶系的活性有明显影响：随着温度的升高酶系活性也随之升高，32℃时酶系活性达到最高为10.2 U/g湿菌体，比28℃时提高36.0%，说明酵母产酶的温度高于其生长最适的温度；在试验条件下，较高的发酵温度有利于酶系的合成，如38℃时酶系活性也高于28℃，但却低于32℃，这是由于较高温度下酵母代谢相对变慢而引起的，且38℃培养时酵母生物量也比32℃下降了17.7%。因此在酿酒酵母生产谷胱甘肽时，采用较高的培养温度即可达到较高的生物量，又可提高谷胱甘肽合成酶系的活性，进而提高谷胱甘肽的产量。

2.2 pH对酵母合成谷胱甘肽合成酶系的影响

调发酵培养基的pH值分别为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，将酵母接种于不同pH的培养基中，于32℃、160 r/min下分别培养20 h，培养过程中pH的控制通过流加3mol/L的H2SO4或3mol/L的NaOH进行调节，结果如图2所示。

图2 不同pH下酵母谷胱甘肽合成酶系活性的变化Fig.2 Changesof theglutathione synthetasesactivity in the S. cerevisiae cellsand biomass cultured under differentpH

由图2可知，pH对酵母谷胱甘肽合成酶系的活性也有明显影响：酵母在相对较低的pH下培养时酶系活性较高，在pH 5.0时酶系活性达到最高为11.1U/g湿菌体，比pH 7.0时高35.4%，这与酿酒酵母的生长最适pH相同。在pH4.0～5.5之间酵母的生物量变化不大，但在pH 7.0时酵母的生物量与pH 5.0相比下降了14.1%。与图1相比，恒pH 5.0下酶系活性提高8.8%，这是由于在图1条件下培养基的初始pH在发酵过程中发生了变化，进而影响到酵母酶系的产率，因此采用恒定pH培养可避免这种影响。

2.3 溶氧对酵母合成谷胱甘肽合成酶系的影响

微生物酶产量与发酵液中的氧含量有直接关系，发酵液中溶氧量与摇床转速有关。取发酵培养基100mL于500mL三角瓶中接种酵母，于32℃、不同摇床转速下培养20 h。摇床转速对酵母谷胱甘肽合成酶系活性的影响如图3所示。

由图3可知，随着转速增加，酵母的生物量和酶系活性都随之上升；在转速160 r/min～200 r/min之间时，酶系活性和生物量都达到相对较高的数值，且基本稳定，因此摇床转速以160 r/min即可。

2.4 无机盐对酵母合成谷胱甘肽合成酶系的影响

图3 摇床转速对酵母合成谷胱甘肽合成酶系和生物量的影响Fig.3 Effectof rotationalspeed on the synthesisof glutathione synthetasesand biom ass

在发酵培养基中分别添加2 g/L的硫酸钠、氯化钠、硫酸钾、氯化钾以替代硫酸镁，将酵母于32℃、160 r/min下培养20 h。结果如图4所示。

图4 无机盐对酵母合成谷胱甘肽合成酶系和生物量的影响Fig.4 Effectof inorganic saltson the synthesisof glutathione synthetasesand biom ass

由图4可知，不同无机盐对酵母谷胱甘肽合成酶系活性的影响不同：当培养基中存在硫酸镁时酶系活性最高；而其他4种盐存在时，与硫酸镁相比酶系活性相对下降较多。硫酸镁使谷胱甘肽合成酶系活性升高的原因是Mg2+为γ—谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶活性中心的辅因子，酶系的合成需要Mg2+的参与。在不同无机盐下培养酵母时，生物量相对变化不大，说明上述无机盐对酵母生长的影响较小。因此，在酵母发酵生产谷胱甘肽合成酶系时，应在培养基中添加一定量的硫酸镁。

2.5 酵母合成谷胱甘肽合成酶系的发酵条件优化

在实际生产中，由于各种因素相互影响，为选出最佳产酶条件，根据单因素对酵母合成谷胱甘肽合成酶系的影响，以培养温度、pH、转速和硫酸镁用量4种因素为影响因子，采用L9（34）正交表进行试验，试验结果及分析见表1。

从表中看出：培养温度、pH、转速和硫酸镁用量四因素对酵母谷胱甘肽合成酶系活性的影响顺序为：转速>pH>温度>硫酸镁用量，其最佳产酶条件为A2B2C3D2，即转速为180 r/min、pH为5.0、培养温度为32℃、硫酸镁用量为2 g/L。此条件下，酵母谷胱甘肽合成酶系活性最高，验证试验其酶系活性为12.5U/g湿菌体。

表1 正交表及试验结果分析Table1 Orthogonal listand the resultanalysisof test

3 结论

酿酒酵母合成谷胱甘肽合成酶系的最适温度与其生长最适温度不同，酵母在32℃培养时，酶系活性高于其最适生长温度；而产酶和生长的最适pH相同，即pH为5.0时，酶系活性最高。酿酒酵母合成谷胱甘肽合成酶系的最佳条件为：摇床转速为180 r/min，发酵液pH为5.0，发酵温度为32℃，培养基中硫酸镁用量为2 g/L，此条件下，酵母谷胱甘肽合成酶系活性可达到12.5U/g湿菌体。本文关于酵母生产谷胱甘肽合成酶系发酵条件的研究，对谷胱甘肽工业化生产具有一定的指导意义。

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Study on Fermentation Conditions of Glutathione Synthetases Producted by S.cerevisiae

DONGYong-sheng，MA Lei，WANGYan-jie
（CollegeofBioengineering，Qilu University of Technology，Jinan 250353，Shandong，China）

The fermentation conditions of glutathione synthetasesproducted by S.cerevisiae NJ-16 were researched，and the optimal conditions of enzymes production were determined as follows：rotational speed180 r/ min，pH 5.0，fermentation temperature 32℃，the dosage ofmagnesium sulphate inmedium was 2 g/L.Under these culture conditions，the activity of glutathione synthetasesproducted by S.cerevisiae NJ-16 was 12.5 U/g wetcell.

S.cerevisiae；glutathione synthetases；fermentation condition

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.24.036

2016-03-25

董永胜（1964—），男（汉），教授，博士，主要研究方向：食品发酵。