简单灵敏的GO-RRS-ET法测定氨基酸

黎小椿，李燕，唐小闲，罗杨合，*，何星存

（1.贺州学院食品科学与工程技术研究院，广西贺州542899；2.大连工业大学食品学院，辽宁大连116034）

简单灵敏的GO-RRS-ET法测定氨基酸

黎小椿1，2，李燕2，唐小闲1，2，罗杨合1，2，*，何星存1，2

（1.贺州学院食品科学与工程技术研究院，广西贺州542899；2.大连工业大学食品学院，辽宁大连116034）

在pH 7.2KH2PO4-NaOH缓冲液和85℃水浴加热的条件下，氨基酸与茚三酮生成蓝紫色的产物罗曼紫（RP），使氧化石墨烯（GO）在400 nm处产生的RRS峰强度降低，这是由于作为供体的GO与作为受体的RP之间发生了RRS能量转移（RRS-ET）所致。随着氨基酸浓度增加，生成的RP增加，RRS-ET增强，400 nm处RRS峰强度线性降低，其降低值在1.33μmol/L～200μmol/L氨基酸浓度范围内呈良好的线性关系，据此建立一种简便、快速、灵敏、选择性高的测定痕量氨基酸的RRS-ET新方法，检测限1.0μmol/L。该方法用于马蹄中氨基酸的检测，测得马蹄果肉氨基酸含量为2.847mg/g，马蹄皮氨基酸含量为1.094mg/g，可为马蹄深加工提高有益参考。

氧化石墨烯；共振瑞利散射；能量转移；茚三酮；氨基酸

自然界中的氨基酸有二十几种，存在于大多数食品和粮食中。氨基酸的分析检测对食品质量监控、农业生产、疾病诊断和治疗等具有重要意义，比如测定羟脯氨酸含量可鉴别牛奶是否为皮革水解蛋白“皮革奶”。当前，利用分子光谱分析氨基酸的主要方法包括分光光度法、荧光法、共振瑞利散射（RRS）法、表面增强拉曼散射（SERS）法、化学发光法等，其中，RRS法是一种简便、快速、高灵敏度的光谱分析方法，已用于痕量金属、非金属、小分子药物、蛋白质、核酸等分析[1-3]。当RRS光谱较强能量较高的物质与RRS光谱较弱能量较低的物质接触时，若前者的RRS光谱与后者的吸收光谱有重叠，两者就会发生共振瑞利散射能量转移（RRS-ET），导致前者RRS光谱减弱，由此建立的RRS-ET新方法已实现了对痕量茶多酚、碘酸根、过氧化氢等物质的检测[4-5]。

氧化石墨烯（GO）是石墨烯的重要衍生物，具有较强的RRS光谱，它不但价格低廉，原料易得，而且具有单层石墨平面结构，含有丰富的含氧活性基团，如羟基、羧基、环氧基，易溶于水，其特殊的结构使其具有高效的吸附性、两亲性、荧光猝灭性和拉曼散射性，已被广泛用于生化分析[6]，但鲜见基于GO的RRSET测定痕量氨基酸的研究报道。氨基酸与茚三酮反应生成的蓝紫色化合物罗曼紫（RP）的RRS光谱较弱，吸收光谱与GO的RRS光谱有一定的重叠。本文利用GO与RP之间发生RRS-ET导致GO的RRS减弱，建立一种简便、快速、灵敏、选择性高的测定痕量氨基酸的新方法，并用于马蹄中氨基酸含量的检测，结果令人满意。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂

F-7000型荧光分光光度计：日立公司；TU-1901型双光束紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；FEIQuanta 200 FEG场发射扫描电子显微镜：荷兰飞利浦公司；纳米粒度和Zeta电位仪：英国马尔文仪器有限公司；SK 1200H超声波反应器：上海科导超声仪器有限公司。

50mmol/L pH 7.2磷酸盐缓冲液（PBS）：上海鹏彩精细化工有限公司；20 g/L茚三酮溶液：上海国药集团；1mmol/L甘氨酸（Gly）：石家庄东华金龙化工有限公司。

0.1 g/L氧化石墨烯（GO，南京先丰纳米材料科技有限公司）：准确称量0.1000 g GO，加水超声溶解后转移至容量瓶，定容至100mL，得到1 g/LGO，使用时以水稀释10倍得到0.1 g/LGO，使用前超声15min。

试验所用试剂均为分析纯级试剂，试验所用水均为亚沸水。

1.2 方法

在试管中依次加入90μLpH 7.2PBS、70μL 20 g/L的茚三酮溶液，分别加入一定量的氨基酸标准溶液[甘氨酸（Gly）、谷氨酸（Glu）、赖氨酸（Lys）、天门冬氨酸（Asp）、苯丙氨酸（Phe）]，85℃水浴加热10min，流水冷却后，加入400μL 0.1 g/LGO，用亚沸水定容到1.5mL。在电压450 v、激发狭缝和发射狭缝均为5 nm、发射滤波器为1%T衰减器、λex-λem=Δλ=0的条件下，用荧光分光光度计同步扫描获得共振瑞利散射（RRS）光谱。测量溶液的RRS强度I，以不加氨基酸标准溶液做试剂空白的RRS值为I0，计算ΔI400nm=I0-I值。

7.2.2梨小食心虫①诱杀越冬幼虫。4月中旬开始在树干上绑诱虫带，诱杀越冬幼虫。②诱捕成蛾。梨小食心虫具趋味性，4月至采摘结束在果园里用广口瓶装糖醋液或者幼虫净诱捕成虫。③喷药防治。第1代在4月上旬防治，9月份集中防治第4代害虫，用药与桃小食心虫相同。④果实套袋，也能避免危害。梨小食心虫在贵州长顺县苹果园的最佳防治措施是从4月中旬开始，每亩果园用30～35套迷向管进行迷向防治，每40～50天更换1次迷向剂，直至苹果采摘结束。

2 结果与讨论

2.1 方法原理

非金属纳米材料GO具有较强的RRS效应。在pH 7.2PBS和水浴加热的条件下，氨基酸与茚三酮生成蓝紫色的配合物罗曼紫（RP），其RRS光谱较弱，能量较低，其吸收光谱与GO的RRS光谱有一定的重叠。当两者接近时，GO将RRS能量转移给RP，导致体系的RRS强度降低。随着氨基酸浓度增加，生成的RP增多，GO转移给RP的RRS能量也随之增多，体系400 nm处的RRS强度线性降低（图1）。据此可建立一种简便、快速、灵敏、选择性高的测定痕量氨基酸的RRS-ET新方法。

图1 氧化石墨烯-氨基酸-茚三酮体系RRS-ET原理图Fig.1 RRS-ET principleof grapheneOxide-am ino acidsninhydrin system

2.2 RRS光谱

Gly-茚三酮-GO体系的RRS光谱如图2所示。

图2 G ly-茚三酮-GO体系的RRS光谱Fig.2 RRSspectra of theG ly-ninhydrin-GO system

GO具有较强的RRS效应，当体系中加入pH 7.2 PBS和茚三酮时，其RRS光谱无明显变化。在pH 7.2PBS和85℃水浴加热条件下，以甘氨酸（Gly）为代表的氨基酸与茚三酮反应生成蓝紫色化合物罗曼紫（RP），其RRS光谱极弱。当GO与RP共存时，体系的RRS光谱强度随着氨基酸浓度的增加而减弱，其中400 nm处RRS减弱最多，并出现了一个峰谷，故本文选择GO体系400 nm RRS峰降低值测量痕量氨基酸含量。

2.3 吸收光谱

在pH 7.6 PBS中，茚三酮的吸收光谱很弱，在350 nm～700 nm没有吸收峰；甘氨酸与茚三酮反应生成的蓝紫色产物罗曼紫在400、565 nm处有2个强度相当的吸收峰，且随着甘氨酸浓度增大，体系的吸收光谱增强。GO的吸收光谱较弱，当体系中加入pH 7.2 PBS和茚三酮时，亦无明显变化。当GO与甘氨酸（Gly）跟茚三酮反应生成的蓝紫色化合物罗曼紫（RP）共存时，体系原来强度相当的400 nm吸收峰便强于565 nm吸收峰（图3）。这证明了GO与RP之间发生了能量转移，是导致GO的RRS光谱强度减弱且400 nm处减弱最多的原因。

图3 Gly-茚三酮-GO体系的吸收光谱Fig.3 Absorption spectra of the G ly-ninhydrin-GO system

2.4 SEM图

由图4（a）和图4（b）可知，GO的粒径在加入Glu前后未发生改变，说明体系RRS光谱强度减弱不是由于体系中纳米粒子粒径的改变引起的，而是由于发生了RRS-ET。

2.5 分析条件的优化

图4 氧化石墨烯的SEM图Fig.4 SEM im agesof GO

以Glu为代表优化了GO-RP体系RRS-ET法测定氨基酸的条件。考察了PBS的pH和浓度、茚三酮溶液浓度、反应温度和时间、GO浓度对RRS光谱的影响。结果表明，当PBS的pH为7.2、浓度为3mmol/L，茚三酮溶液浓度为0.93 g/L，反应温度为85℃、时间10 min，GO浓度为26.7 mg/L，ΔI400nm=I0-I值达到最大。

2.6 工作曲线

在3 mmol/L pH 7.2 PBS、0.93 g/L茚三酮溶液、85℃水浴加热10min、26.7mg/LGO的最优条件下，按试验方法绘制了甘氨酸（Gly）的RRS工作曲线（图5），回归方程ΔI400nm=4.72C+12，R2=0.995 8，Gly浓度线性范围1.33μmol/L～200μmol/L，检测限1.0μmol/L。

图5 G ly-茚三酮-GO的RRS工作曲线Fig.5 RRSworking cureof theG ly-ninhydrin-GO system

2.7 共存物质的影响

按试验方法考察了测定3.33μmol/LGly时其它共存物质的干扰情况，结果表明，在相对误差不超过± 10.0%的范围内，10 000倍的尿素、NO2-、NO3-，500倍的Cl-、Br-、S2-、SO32-、Pb2+和100倍的Mg2+、Ba2+、Cu2+、Fe3+、Zn2+、SO42-等常见物质不干扰测定。对于含有氨基可以与茚三酮反应生成蓝紫色化合物罗曼紫的多肽、蛋白质等干扰物质，可以通过简单的沉淀分离方法除去。因此，本方法具有较好的选择性。

2.8 样品分析

将从市场采购的马蹄洗净，分开马蹄果皮和果肉。称取29.785 0 g马蹄皮于烧杯中，加150mL沸水煮沸15min，抽滤后将滤液转移至容量瓶，定容至250mL。称取68.850 1 g马蹄果肉，用研钵研碎后转移至烧杯中，加150mL沸水煮沸15min，抽滤后将滤液转移至容量瓶，定容至250mL。取适量的马蹄皮和马蹄果肉提取液进行加标回收试验，结果见表2。

表2 样品分析结果（n=5）Table2 Results for detection of samples

由表2可知：1）马蹄果肉氨基酸含量为2.847mg/g，马蹄皮氨基酸含量为1.094mg/g；2）该方法回收率在91.7%～101%之间，相对标准偏差在3.7%～4.2%之间，说明灵敏度较高。

3 结论

本文利用氨基酸与茚三酮在85℃水浴加热条件下反应生成的蓝紫色物质罗曼紫，与非金属纳米材料氧化石墨烯发生共振瑞利散射能量转移（RRS-ET），导致体系400 nm处的共振瑞利散射强度随着氨基酸浓度的增大而线性减弱，据此建立了一种简便、快速、灵敏、选择性高的测定痕量氨基酸的RRS-ET新方法，氨基酸浓度线性范围1.33μmol/L～200μmol/L，检测限1.0μmol/L。该方法用于马蹄中氨基酸含量的检测，测得马蹄果肉氨基酸含量为2.847mg/g，马蹄皮氨基酸含量为1.094mg/g，可为马蹄深加工提高有益参考。

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A Sim ple and Sensitive Graphene Oxide Resonance Rayleigh Scattering-energy Transfer M ethod for Detection of Am ino Acids

LIXiao-chun1，2，LIYan2，TANGXiao-xian1，2，LUOYang-he1，2，*，HEXing-cun1，2
（1.Institute of Food Scienceand Technology，Hezhou University，Hezhou 542899，Guangxi，China；2.School of Food Science and Technology，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034，Liaoning，China）

Nonmetallic nanomaterialgraphene oxide（GO）hasstrong RRSeffect thatexhibited a strong RRS peak at400 nm.In the presence ofpH 7.2 KH2PO4-NaOH buffer solution and 85℃water bath heating，ninhydrin reacted with aminoacids to form blue-violetcomplex Ruhemann'spurple（RP）that reduced the RRSpeak at400 nm due to the RRS-energy transfer（RRS-ET）from the GO as donors to the RPas receptors.With the increase of amino acids concentration，the formed RP increased，and the RRS intensity quenched linearly at 400 nm due to the RRS-ETenhancing.The quenched intensity responds linearlywith amino acids concentration in the range of 1.33μmol/L-200μmol/L.Thus，a new RRS-ETmethod for the determination of trace amino acidswasestablished with the detection limitof1.0μmol/L.Themethod used in the detection ofamino acids in water chestnut，and the amino acid contentof the peeland fleshwere 2.847mg/g and 1.094mg/g respectively.It could bea useful reference for the processing ofwater chestnut.

grapheneoxide；ResonanceRayleigh Scattering；energy transfer；ninhydrin；aminoacids

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.24.023

2016-04-19

国家自然科学基金资助项目（21365011；21367012）

黎小椿（1987—），女（汉），在读硕士研究生，研究方向：食品分析。

*通信作者：罗杨合（1969—），男（汉），教授，博士，研究方向：食品分析。