水产品组织中硝基呋喃类代谢物残留检测方法优化研究

吴明媛，韦信贤，童桂香，兰柳春，杨姝丽

(广西水产科学研究院，广西 南宁 530021)



水产品组织中硝基呋喃类代谢物残留检测方法优化研究

吴明媛，韦信贤，童桂香，兰柳春，杨姝丽*

(广西水产科学研究院，广西 南宁 530021)

优化改进液相色谱-串联质谱法测定水产品组织中硝基呋喃类代谢物残留的方法，用0.3 mol/L盐酸对样品进行水解，2-硝基苯甲醛进行衍生化，37 ℃避光振荡16 h后用磷酸氢二钾与氢氧化钠混合溶液调节水解液pH为7.0～8.0，利用乙酸乙酯进行萃取。萃取液氮吹至干，用甲醇溶液定容，用作HPLC-MS/MS测定。结果表明，4种硝基呋喃代谢物在1～500 ng/mL范围内线性关系良好，加标回收率为92.1 %～103 .0 %，相对标准偏差均小于10.0 %。方法检测下限为0.1 μg/kg。试验证明，该方法稳定可靠，提高了样品处理效率，解决了阳性样品检测值偏低的问题。

硝基呋喃类代谢物；水产品；液相色谱-串联质谱法；优化

硝基呋喃类药物是一类广谱抗生素，因价格较低廉且疗效佳，被广泛应用于畜禽和水产养殖。硝基呋喃类药物具有遗传毒性可能导致基因变异，其原型药在动物体内代谢迅速，稳定性只有数小时，但其代谢物能与蛋白质紧密结合，形成稳定的残留物，残留时间达数周之久[1-5]。欧盟从1997年起，禁止在动物饲料中添加任何硝基呋喃类药物。我国也于2002年颁布了禁止使用硝基呋喃类抗生素的禁令[6]。日本在2006年5月29日起实施食品中农业化学品残留“肯定列表制度”，对硝基呋喃及其代谢物残留制定新的检测限0.5 μg/kg[7]。

硝基呋喃类药物主要有呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因、呋喃西林，其对应的代谢物分别为：3-氨基-2-噁唑烷基酮(AOZ)、5-甲基-吗啉-3-氨基-2-噁唑烷基酮(AMOZ)、1-氨基-2-内酰脲(AHD)和氨基脲(SEM)[8-9]。一般判定动物源性食品中硝基呋喃类药物的残留状况都是通过检测其中硝基呋喃类代谢产物的含量作为依据[10]。

硝基呋喃类代谢物残留检测手段主要有酶联免疫法(ELISA)、高效液相色谱法(HPLC)、高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS)、高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)[11-12]。高效液相色谱-串联质谱法因高灵敏度，定性定量准确已成为主要检测方法。但在按照我国农业部发布的液相色谱-串联质谱法相关标准[13]进行大批量样品检测时发现存在阳性样品检测值偏低的情况。本研究拟通过对样品前处理进行优化，为解决阳性样品检测值偏低的问题提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试仪器：Thermo TSQ Quantum Access MAX液相色谱质谱联用仪(美国Thermo公司)，配电喷雾离子源(ESI)；供试药剂：呋喃唑酮代谢物(AOZ)、呋喃它酮代谢物(AMOZ)、呋喃妥因代谢物(AHD)、呋喃西林代谢物(SEM)(Dr.Ehrenstorfer公司)；AOZ-D4、AMOZ-D5、AHD-13C3、SEM.HCl-13C15N2(Witega公司)；盐酸、2-硝基苯甲醛、二甲基亚砜、氢氧化钠、磷酸氢二钾、乙酸乙酯、甲醇。

本研究中使用的组织样品为实验室中未检出4种硝基呋喃类代谢物的鳗鲡、罗非鱼和对虾作为阴性样品，以及实验室中检出有硝基呋喃类代谢物的鳗鲡，对虾作为阳性样品进行研究。

1.2 色谱条件

色谱柱：Hypersil GOLD C18液相色谱柱(2.1 mm×50 mm，1.9 μm)；流速：200 μl/min；柱温：30 ℃；样品盘温度10 ℃；进样量：20 μl；流动相：A相为甲醇，B相为5 mM乙酸胺 + 0.1 %甲酸水溶液。梯度洗脱程序见表1。

1.3 质谱条件

离子源：电喷雾离子源(ESI)；喷雾电压：3500 V；毛细管温度：350 ℃；鞘气：氮气，50 bar；辅助气：氮气，10 bar；碰撞气：氩气，1.5 mTorr；选择反应监测扫描模式(SRM)，参数见表2。

1.4 试验方法

称取2 g均质后的样品于50 mL离心管中，加入50 μl混合内标工作液，加入5 mL 0.3 mol/L盐酸溶液和150 μl 0.05 mol/L 2-硝基苯甲醛，混匀后置于恒温振荡器中37 ℃避光振荡16 h。取出离心管避光冷却至室温，加入4 mL pH调节剂(1 M磷酸氢二钾∶1 M氢氧化钠=1∶3)，调节pH至7.0～7.5，混匀后加入8 mL乙酸乙酯，振荡5 min，4000 r/min离心5 min。取4 mL上层清液至5 mL玻璃管中，50 ℃下氮吹至干，用5 %甲醇溶液1 mL漩涡混合溶解残留物后，如油脂过多可4000 r/min离心10 min，下层液体过0.22 μm滤膜，待分析。

表1 流动相梯度洗脱程序

2 结果与分析

2.1 水解盐酸浓度的影响

分别用0.1、0.2、0.3 和0.4 mol/L盐酸对阳性样品进行水解，同批样品添加2.5 μg/kg及10 μg/kg两个水平的质控样进行跟标监控，在质控样的加标回收率在90 %～110 %的情况下，由阳性样品检测结果(表3)可以看出，阳性样品在0.1 mol/L盐酸里的只有部分进行了水解，随着盐酸的浓度加大，水解效率不断增加，当盐酸浓度达到0.3 mol/L是达到一个峰值，继续增加盐酸的浓度，水解效率有所下降。因此只有当盐酸浓度达到0.3 mol/L时，阳性样品中的目标物才能完全水解，否则会导致阳性样品最终检测结果偏低。

2.2 衍生化时间的影响

由于4种硝基呋喃类代谢物的分子量为75～201，在此范围背景干扰大，离子化效率低，碎片不具有特征性，因此采用2-硝基苯甲醛对4种代谢物的自由氨基进行衍生化，形成一个具有较好质谱特性的化合物[14-16]。在酸性条件下，亲核基团R-NH2很快游离出来与2-硝基苯甲醛的羰基发生反应[17]。由表4看出，标准溶液和质控样品衍生化1 h后就可以得到一个比较固定的数值，而阳性样品1 h只能衍生化出一部分目标物，随着时间的增加检测结果增大，16 h后达到峰值。因此，样品必需在37 ℃下反应16 h才可以得到稳定且响应值最高的结果，如果时间不够会造成检测结果偏低。但对于标准溶液及加标质控样的衍生，由于不需要经过蛋白质水解，在1 h内可以衍生化完毕。

表2 选择反应监测扫描模式(SRM)质谱参数

注：*为定量离子。

Note：*mean quantitative ion.

表3 水解盐酸浓度对硝基呋喃类代谢物阳性样品结果的影响

表4 衍生化时间对硝基呋喃类代谢物结果的影响

2.3 水解衍生化后调节pH值的影响

5 ppb硝基呋喃代谢物、50 ppb硝基呋喃类代谢物内标物加入阴性组织中按1.4步骤进行水解衍生后，用pH调节剂调至不同pH值后测定，从结果(图1)可以看出，水解液pH值在7～8时，响应值RSD在15 %内，灵敏度变化不大，而且内标法定量采用的定量离子与内标物离子响应值比率RSD在5 %内，对定量影响很小。本研究结果表明，用氢氧化钠溶液调节pH容易过高，磷酸氢二钾调节pH消耗量过大，用磷酸氢二钾与氢氧化钠混合溶液调节pH消耗量小且pH不易过高。处理大批量样品时并不需要对每个样品精确调节pH，可提高实验效率。

图1 pH对4种硝基呋喃代谢物的影响Fig.1 Effects of pH values on response signals of nitrofuran metabolites

2.4 线性关系、检出限和回收率

分别采用4种硝基呋喃代谢物的同位素标记物作为内标物，减少了水解衍生、调节pH等步骤对回收率的影响，使定量更加准确。以各特征离子质量色谱峰面积与相应内标物的峰面积比为纵坐标，对照溶液的浓度为横坐标制作标准曲线，其相应的回归方程和相关系数(表5)如下：由回归方程及相关系数表明，4种硝基呋喃代谢物在1～100 ng/mL范围内线性关系良好，4种被测物检测下限均为0.1 μg/kg。

对水产品组织样品进行3个添加水平测试(表6)，在不同加标水平处理下，AOZ在3组水产品阴性组织中的回收率为95.2 %～103.0 %，其中加标0.5 μg/kg处理下回收高于其它两个加标水平处理；AMOZ在3组水产品阴性组织中的回收率为94.3 %～101.0 %；AHD在3组水产品阴性组织中的回收率为94.3 %～100.0 %；SEM在3组水产品阴性组织中回收率为92.1 %～102.0 %，相对标准偏差(RSD)均在10.0 %以下，说明肌肉组织中的4种硝基呋喃代谢物的阴性样品加标检测都能得到一个稳定可靠的回收率，说明该方法对组织中4种硝基呋喃代谢物能进行稳定的检测。

3 讨论与小结

硝基呋喃类代谢物残留量的测定—(液相色谱—串联质谱法)标准[13]是近年来水产品中硝基呋喃代谢物检测的主要依据，在按照此标准检测样品时发现，即使同批样品的质控回收率满意，阳性样品仍有可能因为水解不完全而结果偏低很多，这是由于样品检测过程中质控措施是在组织样品中加入一定量硝基呋喃代谢物标准溶液，这样添加的硝基呋喃代谢物并不会与蛋白质结合，即使盐酸浓度太低，衍生化时间不长也可以达到满意的回收率。但是对于内源性的硝基呋喃代谢物，由于已经与蛋白质结合，盐酸浓度较低时可能出现水解不完全，检测结果偏低的情况。本研究在该方法的基础上，对高效液相色谱-串联质谱法测定水产品组织中硝基呋喃类代谢物的样品前处理方法各环节进行了优化比较，试验证明影响阳性样品检测值偏低的主要原因是盐酸浓度偏低及水解时间不够。样品检测过程中质控措施是在组织样品中加入一定量标准溶液，这样添加的硝基呋喃代谢物并不会与蛋白质结合，低浓度的盐酸和短时间的水解反应也可以达到较为满意的回收率，而对于阳性样品，由于硝基呋喃代谢物已经与蛋白质结合，酸浓度要达到0.3 mol/L时且样品在37 ℃下需反应16 h才可以达到完全水解。硝基呋喃代谢物残留量的测定[13]要求调节衍生化后的水解液的pH为7.0～7.5，但经本研究发现水解液的pH为7.0～8.0时，对样品的回收率没有太大的影响，因此在处理大批量样品时并不需要精确的调节每个的pH值，只需要调节前面几个样品后固定给后面的每个样品加入同样剂量的磷酸氢二钾与氢氧化钠混合溶液即可。经改进后该方法稳定可靠，可提高样品处理效率，并有效解决阳性样品检测值偏低的问题。

表5 回归方程和相关系数

表6 阴性肌肉组织样品加标回收率及相对标准偏差(n=6)

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(责任编辑 汪羽宁)

Optimization Study on Determination of Residual Metabolites of Nitrofuran in Aquatic Products

WU Ming-yuan, WEI Xin-xian, TONG Gui-xiang, LAN Liu-chun, YANG Shu-li*

(Guangxi Academy of Fishery Sciences，Guangxi Nanning 530021，China)

An improved method for the determination of metabolites of nitrofuran in aquatic products tissues by HPLC-MS/MS was proposed. Samples were hydrolyzed with 0.3 mol/L HCl，and derivatized at 37 ℃ for 16 h with 2-nitrobenzaldenhyde.Hydrolyzed solution was adjusted to pH 7.0-8.0，extracted with ethyl acetate. The analytes were separated and detected by HPLC-MS/MS. The limits of quantification for four nitrofuran metabolites in samples were 0.1 μg/kg. The matrix-matched calibration curve showed good linearity in the range of 1-500 ng/mL. The mean recovery was between 92.1 %-103.0 % and RSD less than 11.1 %.

Metabolites of nitrofuran; Aquatic products; HPLC-MS/MS;Optimization

1001-4829(2016)07-1750-05

10.16213/j.cnki.scjas.2016.07.044

2016-01-12

广西水产畜牧兽医局科研专项基金(桂渔牧发[2015]11号)

吴明媛(1980-)，女，广西南宁人，工程师，主要从事水产品质检工作，*为通讯作者，E-mail：garnet.y@gmail.com。

O657.63

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