广谱持久抗病基因Pi40在云南高原粳稻的应用研究

邹 茜，董丽英，袁平荣，刘慰华，苏振喜，金 雁，寇姝燕*

(1．云南省农业科学院粮食作物研究所，云南 昆明 650205；2．云南省农业科学院农业环境资源研究所，云南 昆明 650205；3．云南省农业科学院农业经济与信息研究所，云南 昆明 650205)



广谱持久抗病基因Pi40在云南高原粳稻的应用研究

邹 茜1，董丽英2，袁平荣1，刘慰华1，苏振喜1，金 雁3，寇姝燕1*

(1．云南省农业科学院粮食作物研究所，云南 昆明 650205；2．云南省农业科学院农业环境资源研究所，云南 昆明 650205；3．云南省农业科学院农业经济与信息研究所，云南 昆明 650205)

对持有主效广谱抗瘟基因Pi40的单基因系4163与其它11份单基因鉴别品系进行自然条件下稻瘟病抗性鉴定。结果表明，4163在云南省粳稻区的稻瘟病重病区均表现抗病，即在保山、宜良、玉溪叶瘟田间抗性分别为0级、0级、4级，穗瘟田间抗性为3级；同时，利用49份有代表性的云南稻瘟病单胞菌株，通过室内接种抗性鉴定方法建立了Pi40对云南稻瘟病的抗谱，并与另外25份抗稻瘟病单基因系进行室内接种同步鉴定比较，结果表明Pi40对49份云南地方稻瘟病菌株的抗病频率为87.8 %，表现出较广的抗谱，可以作为云南高原粳稻抗病育种的新抗源利用。

Pi40；抗谱；稻瘟病；鉴定

据统计云南常年栽种稻谷(包括水、陆稻)100多万hm2，稻瘟病常年发病有33.3多万hm2，占稻谷面积的1/3以上[1]。云南常规水稻生产面积约为60多hm2，其中高原粳稻有53.3多万hm2，其余为地方特色籼稻。由于云南特有的高原立体气候，从国外和省外引进的粳稻品种不能适应高原气候特点，无法在生产上加以直接利用；同时，省外引进的常规籼稻品种稻米直链淀粉含量较高，不能满足边疆民族对品味的需求，因此一直以来，云南省在生产上使用的常规水稻品种都是自主选育品种。虽基本能满足云南省粮食生产需求，但暴露出的问题也日渐突出，集中体现在应用的大多数粳稻品种存在亲本血缘相近，遗传基础狭窄，在生产上导致抵御病虫害能力弱等问题，生产上隐患较大。如云粳25个品种中有23个都有合系34(Pi25)的血源，云粳优1号至15号中，12个为合系34(Pi25)的后代，其余为合系24(Piz)和合系42的后代。其它生产中推广面积较大的楚粳系统、凤稻系统、靖粳系统中，则又都包含云粳的血缘。可以说，近20年来云南水稻常规粳稻生产中利用的抗瘟基因主要是来自合系34的Pi25和来自合系24的Piz这2个基因，抗瘟基因来源过于单一，遗传基础十分狭窄。并且抗瘟基因Pi25为垂直抗性基因[2-3]，若其抗性丧失，生产上潜在导致大面积稻瘟病流行的风险。

表1 苗期叶瘟抗性鉴定材料

随着分子生物学和基因组学的迅猛发展，越来越多的抗稻瘟病基因被鉴定并克隆，这为水稻抗病机制的研究和分子标记辅助育种带来新的契机。根据国家水稻数据库统计结果，截至2013年8月，至少已报道了68个抗稻瘟病位点共83个主效基因，其中Pi40为最新鉴定出的主效广谱抗瘟基因，初步定位于水稻第6染色体短臂上。

本研究针对云南高原粳稻生产中稻瘟病抗性基因遗传基础狭窄，抗源单一的突出问题，引入携带主效广谱抗瘟新基因Pi40的粳稻品系4163，在病圃中进行自然发病，通过与另外11份鉴别品系进行对比，表明4163在云南省粳稻区的稻瘟病重病区表现出田间水平抗性。进一步利用49份有代表性的云南稻瘟病单胞菌株，对4163进行室内接种鉴定，初步明确Pi40的抗谱。同时与另外25份抗稻瘟病单基因系进行抗性频率对比分析，揭示出Pi40在云南高原粳稻育种中有较好的应用前景。

1 材料与方法

1.1 材料及试验地设置

自然条件下叶瘟和穗瘟抗性鉴定材料及其所携带的抗性基因列于表1，蒙古稻为自然诱发介质品种。49份有代表性的云南稻瘟病单胞菌株由云南省农科院资源与环境研究所采集分离、鉴定培养，其详细信息列于表2。研究采用的另外25份单基因系列于表3，其中LTH为丽江新团黑谷，为公认的普感稻瘟病水稻品种，作为对照品种。自然环境下稻瘟病鉴定圃的设置，根据云南省水稻生态区域特点在稻瘟病常发、重发地区设立了3 个病圃，分别位于玉溪市研和镇(属滇西南稻区)，保山市隆阳区试验场(属滇西稻区)，宜良县羊街乡(属滇中稻区)。

人工接种鉴定在云南省农科院资源与环境研究所实验室和昆明温室进行。

1.2 稻瘟病鉴定方法

1.2.1 自然环境下鉴定方法 供试材料于当年晚播，湿润育秧，重施氮肥(施尿素1050 kg/hm2)，每份材料播种100粒左右，材料间隔7 cm，顺序排列不设重复。每垅及鉴定圃四周播蒙古稻作感染品种。当供试材料3叶期时将新鲜采集的病叶插在蒙古稻行，覆水保湿7 d，待大部分供试材料普遍发病时作第1次病情调查，间隔7 d后作第2次病情调查。

1.2.2 稻瘟病单胞菌株培养和室内接种方法 单胞菌株接种于燕麦培养基上进行活化，24 ℃下培养约15 d左右，待菌丝长满培养基后，用自来水洗去气生菌丝，日光灯(400NM)照射下培养2～3 d，经行产孢2～3 d。然后用蒸馏水洗下孢子并加入0.02 %Tween-20制成孢子悬浮液用于喷雾接种，孢子浓度为20～50个/150倍视野(2×105～5×105孢子/mL)。

供试材料置于水中浸泡48 h，然后捞出控干水，置于30 ℃的恒温培养箱中进行催芽，待芽长出0.2 cm左右，即可进行播种。播于装有秧田土的12 cm×18 cm×5 cm塑料育苗盒内，每品种6粒。在温室内育苗，2叶期开始追施尿素0.5 g/盒，共2～3次。3～5叶期进行喷雾接种，接种后的苗置于25 ℃保湿保温箱内24 h。保温培养后取出放在温室内，每天进行定时喷雾以保持温室的湿度，创造有利的发病条件，接种7～10 d后进行发病情况调查。

1.3 稻瘟病抗性评价标准及人工接种分级标准

叶瘟评价标准： 0级全叶片无病斑；1级叶片上有针头状大小的褐点；2级叶片可见较大的褐点；3级有小圆形至稍长的灰色病斑，边缘褐色直径约1～2 mm；4级叶片上有典型纺锤形病斑，长1～2 cm，通常仅局限于2条主脉之间，病斑危害面积少于2 %；5级病斑危害叶面积少于10 %；6级病斑危害叶面积少于25 %；7级病斑危害叶面积少于50 %；8级病斑危害叶面积少于75 %；9级全叶枯死。其中0～1级为高抗(HR)，2～3级为抗(R)，4级为中抗(MR)，5～6级为感病(S)，7～9级为高感(HS)。

表2 从云南不同地方收集分离出的稻瘟病单胞菌株情况

穗瘟评价标准： 0级无病穗或病穗比例小于1 %；1级病穗比率为1.1 %～5 %；3级病穗比率为5.1 %～10 %；5级病穗比率为10.1 %～25 %；7级病穗比率为25.1 %～50 %；9级病穗比率大于50.1 %。

室内接种分级标准共分为5级：0级无病斑；1级叶片上产生褐点型过敏性坏死点，直径小于0.5 mm，不具有产孢能力；2级叶片上产生小的近圆形病斑，直径小于2 mm，病斑中心灰色，病斑周围有褐色的边缘围绕，具有产孢能力；3级典型的梭型稻瘟病病斑，病斑大于2 mm，病斑中心坏死，有褐色的边缘，具有产孢能力；4级水浸状病斑无边缘，病斑可继续扩展。其中，0～2级为抗病型反应，3～4级为感病型反应。

2 结果与分析

2.1 病圃稻瘟病抗性鉴定结果

2010-2012年分别在云南省宜良、保山、玉溪对试验材料进行田间叶瘟鉴定，结果见表4。

从表4可以看出， 引进品系4163在云南保山、玉溪、宜良等不同稻区均表现出抗病的特性，也表明其抗性的广谱性。而其余用于鉴别品系的表现不一，大多表现为感病，只有部分材料为抗，然而其年份间和地点间的差异突出。如，福锦2010和2012年叶瘟抗性等级为3～4级，表现为抗，而2011年在2点均表现为感病，等级为8-9级，这个可能由于不同年份、不同地点的生理小种不同而致。

表3 25个抗稻瘟病单基因系

2.2 Pi40对代表性云南稻瘟病的抗谱反应

选用49份有代表性的云南稻瘟病的单胞菌株4163进行了接种鉴定，以丽江新团黑谷为对照，抗谱结果如表5所示。

从表5看出丽江新团黑谷则均表现为感病，而4163对49份稻瘟病菌株中的43份都表现出抗性反应，仅对09BSH-10-5A、2011-1-1-29-1、2011-1-1-39-1、2011-1-1-19-1、2011-1-1-43-1、2011-1-1-35-1这 6个稻瘟病菌株表现为感病，抗病频率达到87.8 %。该结果表明，携带Pi40抗病基因的品系4163对云南的稻瘟病菌株表现了较广的抗谱，若利用引进的Pi40进行云南稻区水稻品种改良及新种质资源创制具有良好的应用前景。

由表5可见，49份具有代表性的稻瘟病菌株中17份采自保山隆阳稻区，Pi40对这17份菌株均表现为抗性反应，而对于采自其它稻区，甚至保山坝子的菌株的抗性反应则有抗有感，这一结果也佐证了表4中，引进的Pi40高代粳稻回交系4163在除在保山隆阳病圃叶瘟表现高抗外，在宜良和玉溪的病圃中叶瘟均表现为水平抗性。该结果说明与保山当地特殊的稻瘟病菌株相关，也与往年课题组其它育种材料在保山病圃的鉴定结果一致。

表4 供试材料在不同年份、不同地点的叶瘟鉴定

表5 49份代表性单胞菌株对4163的抗谱

2.3 Pi40与其它抗瘟基因的抗性对比

为进一步揭示Pi40在云南高原育种研究中的应用价值，利用上述49份代表性的单胞菌株对另外25份单基因抗性材料进行接种鉴定，其抗谱见图1。

由图1可见，26份材料的抗谱差异较大，抗病频率从6.7 %到100 %；其中Pi9和Pi20对49份菌株均表现抗性，抗性频率达到100 %；而Piks、Pik则抗谱较窄，抗性频率分别为8.2 %和6.7 %，该结果说明在云南水稻种植区域中，Pi9和Pi20是比较有用的抗病基因材料，同时在今后育种中应注意避免Piks、Pik等基因材料的应用。由图1可见，Pi40的抗性频率为87.8 %，稍低于Pi9、Pi20、Pita和Pizt，抗谱广度居于第5位，表明Pi40作为新引进的稻瘟病抗源，对大多数云南稻区的稻瘟病菌株都有良好的抗性，是进行高原粳稻抗病新材料创制的良好抗源供体。

3 讨 论

由子囊菌引发的稻瘟病是世界上最重要的病害之一[4～6]，每年都造成严重的粮食损失。稻瘟病的抗性问题历来是育种工作者急需解决的重大课题。水稻的抗瘟性受不同致病菌株的直接影响，水稻品种的抗病基因对稻瘟病菌的垂直抗性谱存在很大差异[7-11]，抗谱的广度(数量)与抗性的强度(质量)之间有显著的正相关[12]。因此，探明水稻品种对不同菌系的抗性谱，对于了解其适应稻区的广度和预测其抗性维持时间的长短是很必要的，对育种研究者在杂交亲本的选用和配组以及新育成品种的合理布局等方面也有着实际意义[13-14]。

图1 不同单基因系对云南不同稻瘟病株的抗谱Fig.1 Different single-genic lines on the resistant spectrum of different rice blast isolates in Yunnan

本文抗谱测定试验中，选用的49份单胞菌株，其中的大多数在本区田间的分布广度与数量上均占优势。因而，选用这些菌株对正在利用的水稻材料进行抗谱分析，将使研究结果与田间实际紧密联系起来。稻种的抗菌株频率越高，即抗谱越广[15-16]。本文Pi40对49份菌株中的43份都表现出抗性，表明引进的4163品系对本稻区稻瘟病的抗谱较广，作为抗源在后续育种中进行杂交利用，将为云南高原水稻抗病基因遗传基础的拓宽和抗病新材料的创制具有积极作用。

从田间自然诱发和不同生理小种的接种鉴定结果发现一些同源抗性基因的抗谱却不尽相同，比如Pi9、Pizt、Pi2是位于同一位点的同源性抗性基因，但三者的抗谱差异较大，Pi2抗菌谱较窄，这种情况表示，在分子进化过程中NBS-LRR结构[17]的分化可能是导致3个基因抗谱差异的主要原因。此外，在所用到的抗病基因材料中Pi9和Pi20抗谱最宽，Pita和Pizt次之，这些都可作为今后抗性基因抗源加以利用。

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(责任编辑 王家银)

Application Study on Broad-spectrum Blast Resistance GenePi40 in Yunnan Plateau Rice Breeding

ZOU Qian1, DONG Li-ying2, YUAN Ping-rong1, LIU Wei-hua1, SU Zhen-xi1, JIN Yan3, KOU Shu-yan1*

(1.Institute of Food Crops, Yunnan Academy of Agricultural Sciences，Yunnan Kunming 650205，China; 2.Institute of Agricultural Environment and Resources, Yunnan Academy of Agricultural Sciences，Yunnan Kunming 650205，China; 3.Agricultural Institute of Economy and Information, Yunnan Academy of Agricultural Sciences，Yunnan Kunming 650205，China)

The identification of leaf blast resistance was carried out to a new bred line 4163 containing the rice blast resistant genePi40, and another 11 monogenic lines in natural disease nursery. The results showed that 4163 had a good resistant character to Yunnan’s blast isolates. The leaf blast resistance level were 0, 0 and 4 grade in Baoshan city, Yiliang city and Yuxi city respectively, while the neck blast resistance was 3 level. In order to construct a spectrum ofPi40 under Yunnan plateau, 49 typical strains were isolated to inoculate the 4163 in library, and thePi40 showed 87.8 % resistance frequency. While compared to the other 25 resistance genes,Pi40 showed a wide resistant spectrum which indicated that it could be used as the main source of resistance gene in the future Yunnan plateau japonica rice breeding.

Pi40; Resistance spectrum; Rice blast; Identification

1001-4829(2016)07-1493-06

10.16213/j.cnki.scjas.2016.07.001

2014-02-27

云南省应用基础研究项目(2010ZC174)；云南省科技计划项目(2015ZA003)

邹 茜(1980-) ，女，副研究员，主要从事水稻稻瘟病研究工作，E-mail: day14@163.com,* 为通讯作者，E-mail: sy_kou@sina.com。

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