平贝黑腐病发生的土壤微生态机制及拮抗细菌初步筛选*

宋小双 遇文婧 周 琦 邓 勋

（黑龙江省森林保护研究所，哈尔滨 150040）

平贝黑腐病发生的土壤微生态机制及拮抗细菌初步筛选*

宋小双 遇文婧 周 琦 邓 勋*

（黑龙江省森林保护研究所，哈尔滨 150040）

采用土壤微生物学和植物病理学研究方法，以平贝黑腐病发病植株和健康植株根区土壤为研究对象，研究土壤养分、微生物区系组成同平贝黑腐病发生的相关性，并对健康植株根区土壤中黑腐病病原菌的高效拮抗细菌进行了初步筛选。结果表明：根区土壤pH值下降，盐分含量提高及土壤有机质与速效磷、钾供给不足等可导致黑腐病发生；平贝根区土壤微生物区系组成及其多样性的变化，尤其是真菌数量的上升是平贝黑腐病发生的主要原因；分离筛选得到3株可显著抑制黑腐病病原菌生长的细菌菌株，其中菌株SF013对病原菌生长抑制作用最好，对峙培养和发酵液抑菌率分别为79.11%和85.19%。

平贝黑腐病；系统发病机制；生防细菌筛选

平贝黑腐病(Sclerotinia sclerotiorum)是平贝最重要的病害，又名菌核病，属于土传病害，以土壤为媒介进行传播，严重可导致平贝绝产[1]。目前，黑龙江省森工林区平贝栽培已有30多年的历史，主要采取连作模式，有关研究表明，连作条件下作物土传病害的发生与根际土壤微生物区系发生异常变化密切相关[2]，而土壤微生物区系和养分的变化是土传病害发生的主要原因[3-7]，但目前平贝根腐病发生的微生态机制还没有相关报道。因此本文通过对平贝黑腐病发病植株和健康植株土壤微生物区系及养分的比较研究，揭示平贝黑腐病发生的微生态机制，同时筛选平贝健康植株根际土壤中的高效拮抗细菌菌株，旨在为平贝黑腐病的微生态调控修复提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 研究区概况

试验地位于牡丹江市海林林业局三十五林场平贝栽培基地（44°52′41.89″N，129°19′40.92″E），平贝种植面积2.78 hm2，始栽于1980年，为多年连作栽培模式。该地区年有效积温2 400℃，全年日照时数2 540 h，年平均降水量550 mm，无霜期125天左右。近年平贝黑腐病、灰霉病发生严重，发病率50%以上。

1.1.2 采样时间及方法

于2014年5月，在三十五林场平贝栽培地，分别采集平贝健康和发病地块的土壤样品。土壤采集深度为5～10 cm，随机取5个点采集后混合，装入自封袋中带回实验室进行分离。

1.1.3 培养基

细菌、真菌和放线菌所用培养基分别为牛肉膏蛋白胨培养基（BPA）、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）和高氏一号培养基（GA）。

1.2 试验方法

1.2.1 发病与健康地块土壤养分分析

土壤pH值采用电位法，可溶性盐分采用蒸干法，有机质采用重铬酸钾容量法，土壤铵态氮采用氯化钾浸提靛酚蓝比色法，速效磷用碳酸氢钠浸提钼锑抗比色法，速效钾用醋酸铵浸提火焰光度法测定[8]。

1.2.2 发病与健康地块土壤微生物区系的测定

土壤微生物计数采用土壤稀释后平皿涂抹法[9]，对供试土壤样品中的细菌、放线菌和真菌进行计数，每处理设3个稀释度，每个稀释度设3个重复，涂平板后，在操作台中用无菌风吹干平板，置于28℃培养。完成计数统计后，进行土壤微生物多样性计算，包括微生物多样性Shannon-Wienner指数（H）、丰富度指数（S）、均匀度Pielou指数（J）。

1.2.3 平贝黑腐病拮抗细菌的初步筛选

分别采用平板对峙培养法和发酵液抑菌实验[10-12]，测定平贝健康地块根区土壤细菌对平贝黑腐病病原菌的抑制作用，以普通平板为对照，测定菌落直径，按公式计算抑菌率，筛选高效拮抗细菌菌株。

1.2.4 数据处理

试验数据采用进行方差分析，平均数按新复极差法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 发病与健康地块土壤养分分析

通过测定土壤pH值、盐分、有机质、铵态氮、速效磷和速效钾6个指标来比较分析平贝黑腐病发病与健康地块土壤化学性质的差异（表1），通过方差分析结果表明：发病和健康地块测定的土壤指标均存在显著性差异（P＜0.05），其中发病地块土壤盐分和铵态氮分别提高37.28%和12.72%，而有机质、速效磷和速效钾分别降低19.38%、23.61%和32.72%，说明平贝根区土壤中养分的变化，如有机质与速效磷钾供给不足、盐分含量大幅提高及pH下降等土壤化学性质变化是导致平贝黑腐病发生的微生态因素之一。

表1 平贝黑腐病发病地块与健康地块土壤养分分析

2.2 发病与健康地块土壤微生物区系的分析

基于土壤微生物数量组成和多样性分析，同平贝健康植株地块土壤相比，微生物数量存在显著性差异（P＜0.05），平贝黑腐病发病地块土壤细菌、真菌数量分别提高113.15%和68.43%，而放线菌数量降低39.67%（表2）。上述结果表明：平贝健康植株与发病植株根区土壤微生物数量发生变化，其中细菌数量增加与平贝鳞茎发生不同程度腐烂导致组织分解液外渗、土壤营养条件改变、细菌大量生长繁殖有关，而真菌数量增加与土壤微生态环境破坏、平贝黑腐病原真菌大量繁殖有关。

表2 平贝黑腐病发病地块与健康地块微生物数量

发病土壤细菌和真菌的多样性指数H、丰富度指数S、均匀度指数J均低于健康土壤（表3），也反映发病土壤中微生物数量呈现单一化趋势。同微生物数量结合分析可知：平贝黑腐病发病地块病原真菌过量繁殖，导致微生态系统破坏，是土传病害发生的根本原因。

表3 平贝黑腐病发病地块与健康地块土壤微生物多样性（H）、丰富度（S）、均匀度指数（J）指数分析

2.3 平贝黑腐病高效拮抗细菌的初步筛选

通过对峙培养和发酵液抑菌实验，初步筛选得到9株对平贝黑腐病病原菌有抑制作用的细菌菌株（表4），不同菌株对病原菌的抑制作用存在显著性差异（P＜0.05），其中菌株SF013对病原菌生长抑制作用最好，对峙培养和发酵液抑菌率分别为79.11%和85.19%，其次为菌株SF007，对峙培养和发酵液抑菌率分别为77.85%和79.12%，菌株SF003的对峙培养和发酵液抑菌率分别为60.15%和65.25%，对病原菌生长也具有抑制作用。

表4 抑菌率

3 结论

3.1 平贝黑腐病发病与健康植株根区土壤化学性质存在显著差异。

3.2 平贝黑腐病的发生与根区土壤pH值下降，盐分含量提高及土壤有机质与速效磷、钾供给不足等土壤化学性质发生变化有关。

3.3 平贝黑腐病发病与健康植株微生物区系也存在显著差异。发病植株根区土壤中细菌与真菌数量同健康植株相比显著提高，同时微生物多样性、丰富度和均匀度指数均降低，微生物群落结构趋于真菌主导型。

3.4 平贝根区土壤微生态系统中土壤化学性质及根区微生物区系组成及其多样性的变化是平贝黑腐病发生的主要原因，在分析发病微生态机制基础上，测定了健康平贝植株根区土壤细菌对平贝黑腐病菌的抑制作用，筛选得到3株具有生防潜力的细菌菌株，为平贝黑腐病的微生态调控打下良好基础。

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第1作者简介：宋小双（1977-），女，副研究员，博士，主要研究方向：生物防治及生防菌剂研发。通讯作者：邓勋（1978-），男，研究员，博士，主要

（责任编辑：李丹）

Microbial Ecological Study about the Black Rot of Fritillaria ussuriensis and Its Biological Control Bacteria Screening

SONGXiaoshuang
（Forestry Protection Institute of Heilongjiang Forestry Academy,Harbin150081）

Black rot is the most important disease for Fritillaria ussuriensis,In this paper,the root-zone soil of the healthy and disease plant are studied by the method of soil microbiology and plant pathology to understand the micro ecological mechanism of Fritillaria ussuriensis black rot disease,and then screened the biological control bacteria.The results showed that:1)pH value decreased,increase in salt content,soil organic matter and available phosphorus and potassium of root-zone soil,can lead to the occur of black rot disease.2)The composition and diversity of root-zone soil microbial flora,especially the increase of the number of fungi was the main reason for the occurrence of black rot disease.3)Three biological control bacteria were screened by dural culture and fermentation broth inhibition test,in them the strain SF013 have the best inhibition effect,the inhibition rate of dural culture and fermentation broth inhibition test are 79.11% and 85.19%respectively.

Black Rot of Fritillaria ussuriensis;System pathogenesis;Biological control bacteria screening

S567.23+1,S436.631+4

A

1001-9499（2016）06-0018-03

菌物开发利用及林木病害可持续控制。

2016-08-11

*黑龙江省森工总局项目（SGZJY2012016，SGZJY2010014）;国家自然科学基金项目（31200484，31170597）