自发性糖尿病模型KKAy小鼠海马的形态学改变及中药益气养阴散结复方对其影响

田文杨，龙泓竹，吴淑馨，孙宏峰，白 颖，杨晓晖

(北京中医药大学东方医院，北京 100078)



自发性糖尿病模型KKAy小鼠海马的形态学改变及中药益气养阴散结复方对其影响

田文杨，龙泓竹，吴淑馨，孙宏峰，白 颖，杨晓晖*

(北京中医药大学东方医院，北京 100078)

目的 观察自发性糖尿病模型KKAy小鼠海马的形态学改变及中药复方对其的影响。方法 选取雄性11～12周龄KKAy小鼠，将其随机分为模型组及中药组，同周龄雄性C57BL/6J小鼠为正常组。中药组灌服中药复方，模型组及正常组灌服等量蒸馏水，分别于实验的第4、8、12周末处死各组小鼠，通过光镜观察海马组织HE染色、计数海马CA1区神经元细胞数量。结果 第4、8、12周模型组与中药组海马CA1区海马神经元细胞数量与正常组相比，具有统计学意义(P<0.05)。第8周末，海马CA1区神经元形态学发生变化，海马神经元数量减少。第12周末，模型组小鼠神经元细胞出现明显的形态异常，海马细胞排列紊乱，CA1区、齿状回部的多数神经元胞体、胞核出现显著病理性改变，海马神经元数量明显减少。中药治疗组海马组织的神经元细胞排列较整齐，第4、8周末仅见少量神经元细胞深染，第12周末部分神经元细胞发生形态学改变，明显轻于模型组，海马神经元细胞数量与模型组相比有统计学意义(P<0.05)。结论 18～20周龄的KKAy小鼠的海马组织开始出现较明显的神经元细胞损伤及减少的形态学改变，22～24周龄时，这种改变更为显著。该中药复方可有效的调节KKAy的糖脂代谢紊乱，干预和延缓KKAy小鼠海马组织的病理学改变。

糖尿病脑病；海马组织；中药复方；KKAy小鼠

目前，糖尿病发病率逐年升高[1]，其慢性并发症给患者带来的影响逐渐显现[2-3]。糖尿病脑病作为糖尿病主要的并发症之一，受到了越来越广泛的关注。糖尿病脑病主以认知功能下降为主要临床特点，研究发现，随着病程的延长，与认知功能相关的海马区神经元细胞凋亡，继而出现认知下降[4-6]。本研究采用自发性2型糖尿病KKAy小鼠为模型，观察不同时期KKAy小鼠海马组织神经元细胞的改变，探讨KKAy小鼠出现糖尿病脑病的进程，并观察中药复方对KKAy小鼠血糖、血脂的影响,以及对KKAy小鼠海马组织病理学改变的作用，探讨对糖尿病脑病的干预作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 均购自于中国医学科学院医学实验动物研究所：雄性SPF级C57BL/6J小鼠(许可证号：SCXK京2009-0007),10～12 周龄，18只；雄性SPF级KKAy小鼠(许可证号：SCXK京2009-0004),11～12周龄，36只。实验期间，KKAy小鼠喂养高脂饲料(含量配比为10%猪油、10%蛋黄粉和10%葡萄糖)；C57BL/6J小鼠喂养普通小鼠生长维持颗粒饲料，均自由饮水。将小鼠适应性喂养1周后，断尾取血测定空腹血糖，2次空腹血糖均在13.9 mmol/L以上则确定为糖尿病小鼠，纳入实验。实验动物的饲养过程均在东直门医院动物中心完成。

1.2 分组及给药 小鼠适应性饲养1周后，随机分组，C57BL/6J小鼠作为正常组，将18只C57BL/6J小鼠随机分为4、8、12周组，各6只。KKAy小鼠随机分为模型组和中药组，各18只。模型组和中药组再分别随机分为3个小组，即4、8、12周组，各6只。实验所用中药复方由北京中医药大学东方医院中药房提供。小鼠等效剂量的给药量为临床成人每公斤体质量用药量的10倍。中药组予7.7g/(kg·d)灌服中药益气养阴散结复方，模型组及正常组予灌胃同体积的蒸馏水，分别灌胃4、8、12 周。

1.3 试剂与仪器 10%水合氯醛10 g，用双蒸水稀释至100 mL。稳豪型血糖仪及原厂试纸：美国强生公司。低温高速离心机：Heraeus sepatech biofuge 28RS。隔水式恒温培养箱(国产)：GNP-9080型。

1.4 标本采集及处理 在给药后第 4、8、12周末处死动物称取小鼠体质量后，用10%水合氯醛按0.4 mg/100 g的剂量进行腹腔注射，小鼠成功麻醉，腹主动脉采血，12 000 r/min，离心15 min，静置备用待测血糖、血脂，剪开颅骨，将整个大脑完整移至4%多聚甲醛中浸泡等待包埋,待做HE染色。

1.5 检测指标及方法 1)记录小鼠一般情况、小鼠活动状态、毛色、精神状态、饮食、二便等，每周测体质量1次。2)血糖、血脂：处死前取血检测血糖、血脂。3)大脑组织HE染色观察海马组织形态学改变。4)海马CA1区神经元细胞计数：400倍显微镜下，随机选取海马CA1区不重叠的3个视野，计数正常的细胞数量，取其平均值，每个标本取3张连续切片，取其平均值。对结果进行统计学分析处理。

2 结果

2.1 各组小鼠的一般情况 正常组C57BL /6J进食饮水正常，毛色亮泽，精神状态良好，反应灵敏，对抓取抵抗明显；模型组KKAy小鼠形体肥胖，体质量增长迅速，逐渐出现毛色干枯无光泽，活动迟缓，反应迟钝。中药组干预治疗8周后小鼠一般状况较模型组具有不同程度改善。

2.2 各组小鼠血糖测定情况 见表1。

mmol/L

注:与正常组比较，#P<0.05，##P<0.01;与模型组比较，△P<0.05

2.3 各组小鼠TG、TC测定情况 见表2,表3。

mmol/L

注:与正常组比较，##P<0.01;与模型组比较，△P<0.05

mmol/L

注:与正常组比较，##P<0.01；与模型组比较，△P<0.05

2.4 各组小鼠脑组织HE染色情况 光镜下观察各组小鼠海马组织HE染色，正常组小鼠在第4、8、12周末均可见海马CA1区、齿状回部(DE区)神经元细胞排列整齐，结构清晰，细胞圆，胞浆淡染，胞质清晰可见，核仁清楚。模型组小鼠在第4周末时，海马CA1区神经元细胞排列较整齐，与第4周末的正常组小鼠相比，可见少许散在的神经元细胞深染。模型组小鼠在第8周末时，海马CA1区神经元细胞排列松散，形态发生变化，部分神经元细胞出现较明显的细胞核固缩、细胞质减少。在12周末，模型组小鼠神经元细胞出现了非常明显的形态异常，海马细胞层次差，排列紊乱，数目减少，CA1区、齿状回部的多数神经元胞体深染、皱缩，胞核变小、固缩浓染或胞核消失，细胞变细、变长。中药治疗组海马神经元细胞排列较整齐，在第4、8周末仅可见少量神经元细胞深染，未见明显形态学改变，虽然在第12周末部分神经元细胞发生了形态学改变，但与模型组相比，程度明显轻于模型组。

2.5 各组小鼠脑组织海马区计数 见表4。

个

注:与正常组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较，△P<0.05

3 小结

本实验结果显示，与正常小鼠相比，在第4、8、12周末，模型组小鼠的血糖和血脂水平均明显高于正常组,但在第4周末，即14～16周龄的模型组KKAy小鼠海马组织的形态学并没有发生明显变化,提示此时KKAy小鼠尚未出现明显的神经元细胞损伤。从第8周末后，模型组小鼠海马组织存在了较明显的改变，神经元数目减少明显，说明18～20周龄的KKAy小鼠已经开始出现了神经元损伤，但其临床表现并不明显。到了第12周末，长期处于高血糖、高血脂的状态使模型组KKAy小鼠海马组织CA1区、DE区神经元细胞的胞体、胞核等出现显著的病理学改变，神经元数目减少较多，与此同时模型组小鼠反应迟钝，活动迟缓，对抓取抵抗不明显，提示22～24周龄KKAy小鼠存在明显神经元损伤，出现了糖尿病脑病的改变[7-11]。

本实验所用中药复方具有益气养阴，通络散结的功效，以往研究[12]发现该复方可通过干扰肾素血管紧张素系统(RAS)激活，减少AngII蛋白过度表达，抑制心肌重构从而保护心肌功能，延缓糖尿病心肌病的进程；本中药复方补气阴以充髓海的同时，化痰活血通络以除脑窍之结，早期干预以延缓糖尿病脑病发展。实验发现通过中药复方干预，中药组KKAy小鼠海马形态学较模型组有较明显的改善，中药组小鼠在第4、8周末仅可见少量神经元细胞深染,未见明显的神经元细胞形态学改变，直至第12周末才出现部分神经元细胞发生了形态学改变，提示通过该中药复方的干预，有效的延缓和阻止了糖尿病脑病的发生进程。本实验发现，中药复方可有效改善自发性KKAy糖尿病小鼠的糖脂代谢紊乱,这可能对预防和干预糖尿病小鼠海马组织形态学改变有着重要意义。

综上所述，KKAy小鼠作为自发性糖尿病动物模型，在18～20周龄时，其海马组织开始出现较明显的神经元细胞损伤及减少的形态学改变，22～24周龄时，这种改变更为显著。益气养阴散结复方可有效的干预和延缓KKAy小鼠海马组织神经元的损伤和减少，这种对神经元的保护作用部分可能通过降低血糖、血脂而实现的，但其具体作用的环节和靶点，有待于进一步研究。

[1]International Diabetes Federation.IDF Diabetes Atlas[S].6th edn.2013.

[2]GAO Yuxia,XIAO Yanyu,MIAO Rujuan,et al.The prevalence of mild cognitive impairment with type 2 diabetes mellitus among elderly People in China:A cross-sectional study[J].Archives of Gerontology and Geriatrics,2015,62(62):138-142.

[3]GUDALA K,BANSAL D,SCHIFANO F,et al.Diabetes mellitus and risk of dementia:A meta-analysis of prospective observational studies[J].Journal of Diabetes Investigation,2013,4(6):640-650.

[4]AMIN SHAIMAA-N,YOUNAN S M,YOUSSEF M F,et al.A histological and functional study on hippocampal formation of normal and diabetic rats[J].F1000Research,2013(2):151.

[5]ZHAO Yongmei,YAN Ying,ZHAO Zhiwei,et al.The dynamic changes of endoplasmic reticulum stress pathway markers GRP78 and CHOP in the hippocampus of diabetic mice[J].Brain Research Bulletin,2015(111):27-35.

[6]MC CRIMMON R J,RYAN C M,FRIER B M.Diabetes and cognitive dysfunction[J].Lancet,2012,379(9833):2291-2299.

[7]冷一平,禹华旭.糖尿病脑病:起病隐匿机制复杂的并发症[J].中国糖尿病杂志,2013,21(12):1144-1145.

[8]NINOMIYA T.Diabetes mellitus and dementia[J].Current Diabetes Reports,2014,14(5):487-496.

[9]ROBERTS R O,KNOPMAN D S,PRZYBELSKI S A,et al.Association of type 2 diabetes with brain atrophy and cognitive impairment[J].Neurology,2014,82(13):1132-1141.

[10]韦云飞,江文宇,林卫,等.2型糖尿病认知障碍及海马体积与血糖水平关系研究[J].广西医科大学学报,2015,32(5):725-728.

[11]王宪玲,贾建平.自发性2型糖尿病小鼠发病早期认知功能的研究[J].首都医科大学学报,2007,28(1):75-77.

[12]杨晓晖,吴淑馨,张力,等.糖尿病大鼠心肌组织AngⅡ变化及益气养阴散结中药复方对其影响的实验研究[J].中国药物警戒,2013,10(4):196-199.

Morphological changes in hippocampus and effect of Yiqi Yangyin Sanjie prescription on KKAy mice with spontaneous type 2 diabetes

TIAN Wenyang,LONG Hongzhu,WU Shuxin,SUN Hongfeng,BAI Ying,YANG Xiaohui*

(Dongfang Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100078,China)

Objective To observe the morphological changes of the hippocampus of the KKAy mice and the effect of traditional Chinese medicine compound on the morphology of hippocampus.Methods The 12-week-old male KKAy mice were randomly divided into model group and TCM group,same age of male C57BL/6J mice were chose as the normal group.The mice of different groups were treated with relevant medicinal respectively by intragastrical method,as the TCM group were fed with Traditional Chinese medicine compound,the model group and normal group were fed with distilled water.The hippocampal pathological changes were observed under light microscope and counted the number of hippocampal neurons after mice were sacrificed respectively when the end of 4th,8th and 12th weeks.Results At the end of 4th,8th and 12th weeks,in the model group and TCM group,the number of hippocampal neurons have significantly statistical differences compared with the normal group (P<0.05).At 8 weeks,the morphology of neurons in CA1 area of hippocampus were changed.The cell nuclei of some neurons appear to shrink and cytoplasm increased,the neuronal loss decrease.At 12 week,in the model group,the morphology of the hippocampus of the KKAy were significant abnormality.In TCM group,the pathological changes of the hippocampus of KKAy mice were significantly less than that of the mod-el group,the number of hippocampal neurons have significantly statistical differences compared with the model group (P<0.05).Conclusion At 18-20 week of age,the morphology of hippocampus of KKAy mice began to appear obvious changes.At 22-24 week of age,the pathological changes were more significant.The Chinese medicine compound can effectively prevent and reduce the damage of neurons of the hippocampus of KKAy mice.

diabetic encephalopathy;hippocampus tissue;traditional Chinese medicine compound;KKAy mice

10.13463/j.cnki.cczyy.2016.06.010

教育部高等学校博士学科点专项科研基金(博导类)(20110013110004)。

田文杨(1990-)，女，硕士研究生，主要从事中医药防治糖尿病及并发症研究。

R285.5

A

2095-6258(2016)06-1129-04

辑：张海洋

2016-04-06)

*通信作者：杨晓晖，男，教授，主任医师，博士研究生导师，电子信箱-yxh0616@126.com