线性探针技术在贵州地区耐药结核病诊断中的应用价值

郑雯琳 张铭 袁薇 陈依江

(贵州省疾病预防控制中心，贵州 贵阳 550004)



线性探针技术在贵州地区耐药结核病诊断中的应用价值

郑雯琳 张铭 袁薇 陈依江

(贵州省疾病预防控制中心，贵州 贵阳 550004)

结核分枝杆菌； 线性探针； 耐药性

结核病是全球严重的公共卫生问题之一，据世界卫生组织(WHO)报告[1]，每年有约145万人死于该病。我国近年来结核病的发病率也日趋上升，现已有结核病人450万例，且每年病死13万例。其中耐多药结核病是我国现阶段结核病防控工作面临的最大挑战之一[2]。为了进一步推进耐多药结核病防治工作，近年来我国已经开始引进耐药结核分枝杆菌分子生物学快速检测技术以代替耗时的需借助于培养基的常规检测方法。本研究对贵州本地200例分离培养结核分枝杆菌菌株进行检测，与传统比例法结果进行对比，探讨该方法针对贵州地区的耐药结核分枝杆菌的应用价值。

1 材料与方法

1.1 研究对象 贵州罗甸200株痰培养阳性菌株。

1.2 研究方法

1.2.1 传统药物敏感性试验 利用传统药物敏感试验检测结核分枝杆菌对利福平、异烟肼两种一线抗结核药物的耐药性，作为诊断试验的金标准。

1.2.2 线性探针技术提取DNA 取500 μL处理后痰标本加入1.5 mL离心管内，10 000×g 离心15 min；弃上清，加入500 μL去离子水，涡旋震荡重悬沉淀物。10 000×g离心15 min；95 ℃水浴中孵育20 min；超声裂解15 min。12 000×g 离心10 min，取5 μL上清液用于PCR检测。

1.2.3 扩增 采用德国Hain LifescienceGmbH 公司生产的GenoType MTBDRplus试剂盒在PCR仪上对结核杆菌DNA 模板进行扩增。扩增体系：35 μL PNM，5 μL 10×buffer，0.2 μL DNA聚合酶，2 μL MgCl2溶液，2.8 μL ddH2O，5 μL DNA模板，最终容积达到50 μL。扩增条件：95 ℃，15 min;(95 ℃，30 s，58 ℃，2 min)，10个循环；(95 ℃，25 s，53 ℃，40 s，70 ℃，40 s)，30个循环；70 ℃，8 min，4 ℃，1 h。

1.2.4 杂交 将PCR 扩增产物和变性裂解液(DEN)各20 μL混匀加入杂交反应板，孵育5 min,然后加入杂交缓冲液(HYB)1 mL，混匀，将标记好的探针试条加入槽中，在杂交仪上45 ℃孵育30 min后将杂交液彻底吸出，再加入1 mL严格漂洗液(STR)，45 ℃杂交仪孵育15 min。在每个槽中加入1 mL按1∶100稀释的标志物，杂交仪振动平台上孵育30 min。再向每个槽中1∶100稀释的底物并静止避光孵育5～10 min。将试条取出置于吸水纸上干燥，然后粘贴在判读表上。

1.3 结果判读 线性杂交技术结果试纸条共有27 个反应条带，分为4个区域，第一区为对照质控带，其他区为耐药相关基因探针区，其中第二区是利福平耐药相关rpoB 基因探针区，第三和第四区分别为异烟肼耐药相关的KatG、inhA 基因探针区，当野生条带均显色而突变条带无显色时为药物敏感，野生条带缺失、突变条带显色或不显色均为耐药。

1.4 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行数据处理，检测结果的真实性采用敏感度和特异度对其进行评价，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 比例法药敏结果 利福平耐药27例，利福平敏感173例，异烟肼耐药18例，异烟肼敏感182例。

2.2 线性探针技术结果 利福平耐药27例，利福平敏感173例，异烟肼耐药18例，异烟肼敏感182例。

2.3 两种方法比较 两种方法对利福平检测结果一致的有200例，两种方法均为耐药的27例，均为敏感的173例; 两种方法对异烟肼检测结果一致的有200例，两种方法均为耐药的18例，均为敏感的182例。线性探针GenoType MTBDRplus方法检测利福平耐药的灵敏度为100%，特异度为100%，阳性预测值为1，阴性预测值为1 ; 检测异烟肼的灵敏度为100%，特异度为100%，阳性预测值为 1 ，阴性预测值为1 。线性探针技术技术与传统药敏实验检测所得利福平耐药结核病发生率、异烟肼耐药结核病发生率和耐多药结核病发生率比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.4 基因突变频率分布 对GenoType MTBDRplus 检测耐利福平及耐异烟肼的突变位点进行了分析，耐利福平基因突变频率最高的是S531L(66.7%)，耐异烟肼基因突变频率最高的为 S315T1(88.9%)。见表1。

表1 线性探针技术检测利福平和异烟肼耐药基因的突变频率分布

3 讨 论

线性探针杂交技术检测作为分子诊断，其原理是基于对基因序列的分析而进行的结核分枝杆菌及其耐药性诊断。实验方法与传统的药物敏感性实验相比简单，且检测速度较快，目前已在很多国家使用。但有研究显示，耐药水平的高低会影响HAIN技术的检测效果[3]。WHO 2014 年版《耐药结核病规划管理指南伙伴手册》对药敏试验进行了更新，指出药敏试验包括了表型药敏试验(即传统药敏试验) 和基因型药敏试验; 结核分枝杆菌对利福平的耐药定义为表型或基因型药敏试验发现利福平耐药[4]。说明分子检测对耐药结核病诊断的重要性，意味着一旦发现利福平基因型耐药，就需要考虑其为耐药结核的可能性[5]。

本研究中，GenoType MTBDR plus 检测利福平耐药的灵敏度达100%，与此前国外的研究结果一致[6-7]。已有研究显示利福平耐药由编码RNA聚合酶β亚单位的rpoB 基因核心区的基因突变引起。本研究检测利福平耐药表现出较高的灵敏度和特异度。由于不同地区结核分枝杆菌耐利福平的基因突变位点突变频率均不同，本研究显示，耐利福平基因突变频率最高的是rpoB S531L,故提示贵州地区利福平耐药主要以rpoB S531L 为主。异烟肼耐药主要与katG 和inhA 基因有关，katG 基因突变与高水平耐药相关， inhA 耐药与低水平耐药相关。本研究显示，异烟肼耐药主要基因突变为katG S315T1，提示贵州地区88.9%的耐异烟肼病例为高水平耐药。

[1] World Health Organization. Global tuberculosis control: WHO report 2011[R]. Geneva: World Health Organization, 2011.

[2] 卫生部．全国结核病耐药性基线调查报告(2007-2008年)[M]．北京：人民卫生出版社，2010．

[3] World Health Organization. Compannion handbook to the WHO guidelines for the programmatic management of drug-resistant tubercuosis[R]. Geneva: World Health Organization, 2014．

[4] 段鸿飞. WHO 2014 年版《耐药结核病规划管理指南伙伴手册》解读之六[J]. 中国防痨杂志,2015,37(6):658-659．

[5] Causse M, Ruiz P, Gutierrez JB,et al.Evaluation of new Geno-Type MTBDRplus for detection of resistance in cultures and direct specimens of Mycobacterium tuberculosis [J].Int J Tuberc Lung Dis,2008,12(12):1456-1460．

[6] Lacoma A, Garcia-Sierra N, Prat C, et al. GenoType MTBDRplus assay for molecular detection of rifampin and isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis strains and clinical samples [J]. J Clin Microbiol,2008,46(11):3660-3667．

[7] Miotto P, Piana F, Cirillo DM, et al.Genotype MTBDRplus: a further step toward rapid identification of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis [J]. J Clin Microbiol, 2008,46(1):393-394．

贵州省疾病预防控制中心基金项目(2015-E2-4)

R52

B

1000-744X(2016)11-1214-02

2016-06-08)