恶性淋巴瘤诊断中荧光原位杂交分析基因状态的研究

沈小英 亓岽东 武鑫瑞 屈悦 张立英 张玉萍 许春伟 吴继华☆

(1.解放军306医院病理科，北京 100101；2.大连大学附属中山医院肿瘤科，辽宁 大连 116001；3.北京新基永康基因科技有限公司，北京 100085；4.北京军区总医院病理科，北京 100700；5.山东省潍坊市人民医院病理科，山东 潍坊 261041；6.军事医学科学院附属医院病理科，北京 100071)



恶性淋巴瘤诊断中荧光原位杂交分析基因状态的研究

沈小英1亓岽东2武鑫瑞1屈悦3张立英4张玉萍5许春伟6△吴继华1☆

(1.解放军306医院病理科，北京 100101；2.大连大学附属中山医院肿瘤科，辽宁 大连 116001；3.北京新基永康基因科技有限公司，北京 100085；4.北京军区总医院病理科，北京 100700；5.山东省潍坊市人民医院病理科，山东 潍坊 261041；6.军事医学科学院附属医院病理科，北京 100071)

目的 探讨恶性淋巴瘤中基因重排的特点。方法 回顾性分析87例恶性淋巴瘤组织样本，利用荧光原位杂交技术，分别检测弥漫大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤和间变性大细胞淋巴瘤中BCL-6、BCL-2、MALT1、CCND1、C-MYC和ALK基因重排。结果 弥漫大B细胞性淋巴瘤中BCL-6基因重排的阳性率为29.03%(9/31)，滤泡性淋巴瘤中BCL-2基因重排的阳性率为61.11%(11/18)，黏膜相关淋巴组织淋巴瘤中MALT1基因重排的阳性率为47.37%(9/19)，套细胞淋巴瘤中CCND1基因重排的阳性率为88.88%(8/9)，Burkitt淋巴瘤中C-MYC基因重排的阳性率为100%(2/2)和间变性大细胞淋巴瘤中ALK基因重排的阳性率为75.00%(6/8)。结论 基因重排对恶性淋巴瘤的诊断具有重要的实际价值。

淋巴瘤； BCL-6基因； BCL-2基因； MALT1基因； CCND1基因； C-MYC基因；ALK基因

恶性淋巴瘤作为淋巴系统的原发的恶性肿瘤，由于其具有高度异质性，因此其诊断一直是病理诊断的重点和难点[1]。目前恶性淋巴瘤的诊断根据WHO(2008版)造血和淋巴组织肿瘤分类需运用病理形态学、免疫组化、分子遗传学和临床特征四者有机结合来确诊[2]。在病理形态学、免疫组化和临床特征仍不能确诊的病例，分子基因检测显得尤为重要。其中荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization,FISH)为一种敏感性高的检测方法。恶性淋巴瘤分子病理诊断中荧光原位杂交的探针分为融合探针和断裂探针，一般融合探针用于融合伙伴较少的基因，如弥漫大B细胞淋巴瘤的BCL-2/IGH融合探针和套细胞淋巴瘤的CCND1/IGH融合探针，其特异性较高，而断裂探针主要用于融合伙伴较多的基因，如滤泡性淋巴瘤的BCL-6断裂探针、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤的MALT1断裂探针、Burkitt淋巴瘤的C-MYC断裂探针和间变性大细胞淋巴瘤的ALK断裂探针[3-5]。本文运用荧光原位杂交分析上述恶性淋巴瘤中的基因重排情况，探讨荧光原位杂交在恶性淋巴瘤诊断中的临床应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本 收集2013年1月至2015年12月间解放军306医院、大连大学附属中山医院、北京军区总医院和山东省潍坊市人民医院送检进行荧光原位杂交的恶性淋巴瘤标本87例，其中弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)31例，滤泡性淋巴瘤(FL)18例，黏膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)19例，套细胞淋巴瘤(MCL)9例，Burkitt淋巴瘤(BL)2例，间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)8例。

1.1.2 主要试剂 BCL-2/IgH融合探针、CCND1/IgH融合探针、BCL-6断裂探针、C-MYC断裂探针、MALT1断裂探针和ALK断裂探针及缓冲液均购自广州安必平(LBP)医药科技有限公司。

1.2 方法 荧光原位杂交(FISH)检测步骤：4 μm石蜡薄切片，74 ℃烤箱中15 min，环保脱蜡剂脱蜡，酒精脱水，蒸馏水高压水煮放气后4 min。37 ℃ 0.01N HCl的胃蛋白酶中水浴消化60 min，加4 μL探针，85 ℃变性5 min，42 ℃杂交16 h，室温下2× SSC/0.1%NP-40溶液中洗涤，10 μL的DAPT复染。以反应性淋巴组织为正常对照，结果在荧光显微镜下观察。以上过程从加探针开始需避光操作。荧光原位杂交(FISH)检测判读：(1)BCL-2/IGH融合探针：在正常细胞核中出现红、绿信号各2个(2R2F)，存在t(14,18)易位的细胞中出现1个红色、1个绿色信号和1个融合的黄色信号(1R1G1F)，或出现2个融合黄色信号(1R1G2F)。肿瘤细胞出现黄色信号>5%的确定为t(14,18)易位。(2)CCND1/IGH融合探针：在正常细胞核中出现红、绿信号各2个(2R2F)，存在t(14,18)易位的细胞中出现1个红色、1个绿色信号和1个融合的黄色信号(1R1G1F)，或出现2个融合黄色信号(1R1G2F)。肿瘤细胞出现黄色信号>15%的确定为t(11,14)易位。(3)BCL-6断裂探针：正常细胞核中出现2个黄色信号(2F)。存在3q27重排时细胞中出现1个红色、1个绿色信号的分离信号和1个黄色信号(1R1G1F)；肿瘤细胞中出现1个红色、1个绿色分离信号>10%的确定为有3q27重排。(4)C-MYC断裂探针：正常细胞核中出现2个黄色信号(2F)。存在8q24重排时细胞中出现1个红色、1个绿色信号的分离信号和1个黄色信号(1R1G1F)。肿瘤细胞中出现1个红色、1个绿色分离信号>15%的确定为有8q24重排。(5)MALT1断裂探针：正常细胞核中出现2个黄色信号(2F)。存在18q21重排时细胞中出现1个红色、1个绿色信号的分离信号和1个黄色信号(1R1G1F)。肿瘤细胞中出现1个红色、1个绿色分离信号>10%的确定为有18q21重排；(6)ALK断裂探针：正常细胞核中出现2个黄色信号(2F)。存在2p23重排时细胞中出现1个红色、1个绿色信号的分离信号和1个黄色信号(1R1G1F)。肿瘤细胞中出现1个红色、1个绿色分离信号>15%的确定为有2p23重排。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0软件进行数据分析，计数资料以率(%)表示，采用χ2检验及Fisher确切概率法，α=0.05为检验水准。

2 结 果

2.1 荧光原位杂交的结果 弥漫大B细胞淋巴瘤中BCL-6基因重排阳性率为29.03%(9/31)，依据Hans模型[1]采用免疫组化方法标记CD10、BCL-6 和MUM1，将DLBCL分为生发中心细胞(Germinal center b-cell,GCB)[CD10+,BCL-6+/-,MUM1+/-或CD10-,BCL-6+,MUM1-]和非生发中心细胞(non-GCB)[CD10-,BCL-6+/-,MUM1+或CD10-,BCL-6-,MUM1-]起源，其中GCB起源占16.67%(2/12)，non-GCB起源占36.84%(7/19)(图1)；滤泡性淋巴瘤中BCL-2基因重排阳性率为61.11%(11/18)，分级方面其中5例Ⅰ级中BCL-2基因重排阳性率为22.22%(4/18)，6例Ⅱ级中BCL-2基因重排阳性率为22.22%(4/18)，Ⅲa级中BCL-2基因重排阳性率为11.11%(2/18)，Ⅲb级中BCL-2基因重排阳性率为5.56%(1/18)(图2)；黏膜相关性淋巴组织淋巴瘤中MALT1基因重排阳性率为47.37%(9/19)，其中10例胃肠道黏膜相关性淋巴组织淋巴瘤中MALT1基因重排阳性率为31.58%(6/19)，9例非胃肠道黏膜相关性淋巴组织淋巴瘤中MALT1基因重排阳性率为15.79%(3/19)(图3)；套细胞淋巴瘤中CCND1基因重排阳性率为88.88%(8/9)，除1例CD5阴性，CyclinD1阳性样本外CCND1/IGH融合探针检测均为阳性(易位)(图4)；Burkitt淋巴瘤中C-MYC基因重排阳性率为100%(2/2)，且均为EBER原位杂交阴性(图5)；间变性大细胞淋巴瘤中ALK基因重排阳性率为75.00%(6/8)，其中ALK蛋白阳性样本均为阳性，ALK蛋白表达阴性样本均为阴性(图6)。

2.2 不同性别恶性淋巴瘤患者基因的状态情况 BCL-6基因重排在18例弥漫大B细胞淋巴瘤男性患者中的阳性率为27.78%(5/18)，在13例女性患者中为30.77%(4/13)，差异无统计学意义(P=0.856)；BCL-2基因重排在11例滤泡性淋巴瘤男性患者中的阳性率为63.64%(7/11)，在7例女性患者中为57.14%(4/7)，差异无统计学意义(P=0.783)；MALT-1基因重排在10例黏膜相关性淋巴瘤男性患者中的阳性率为40.00%(4/10)，在9例女性患者中为55.56%(5/9)，差异无统计学意义(P=0.498)；CCND1基因重排在6例套细胞淋巴瘤男性患者中的阳性率为83.33%(5/6)，在3例女性患者中为100%(3/3)，差异无统计学意义(P=0.453)；C-MYC基因重排均为2例Burkitt淋巴瘤男性患者；ALK基因重排在5例间变性大细胞淋巴瘤男性患者中的阳性率为60.00%(3/5)，在3例女性患者中为100%(3/3)，差异无统计学意义(P=0.206)。

2.3 不同年龄群体恶性淋巴瘤患者基因的突变情况 BCL-6基因在3例青少年(<18岁)弥漫大B细胞淋巴瘤患者中的阳性率为33.33%%(1/3)，在5例年轻患者(18～44岁)中为20.00%(1/5)，在11例中年患者(45～59岁)中为27.27%(3/11)，在12例老年患者(60～90岁)中为33.33%(4/12)，差异无统计学意义(P=0.951)；BCL-2基因在3例年轻滤泡性淋巴瘤患者(18～44岁)中的阳性率为66.67%(2/3)，在9例中年患者(45～59岁)中为55.55%(5/9)，在6例老年患者(60～90岁)中为66.67%(4/6)，差异无统计学意义(P=0.890)；MALT1基因在2例年轻黏膜相关性淋巴瘤患者(18～44岁)中的阳性率为50.00%(1/2)，在7例中年患者(45～59岁)中为57.14%(4/7)，在10例老年患者(60～90岁)中为40.00%(4/10)，差异无统计学意义(P=0.782)；CCND1基因在3例中年患者(45～59岁)中为100%(3/3)，在6例老年患者(60～90岁)中为83.33%(5/6)，差异无统计学意义(P=0.453)；C-MYC基因重排在2例青少年Burkitt淋巴瘤患者(<18岁)中的阳性率为100%(2/2)；ALK基因重排在4例年轻间变性大细胞淋巴瘤患者(18～44岁)中的突变频率为100%(4/4)，在1例中年患者(45～59岁)中为100%(1/1)，在3例老年患者(60～90岁)中为33.33%(1/3)，差异无统计学意义(P=0.153)。

3 讨 论

恶性淋巴瘤作为常见肿瘤，近年来发病率和死亡率在全球范围内明显增加，其中发病率占恶性肿瘤的4%～5%，居第6位，死亡率占恶性肿瘤的3%～4%，居第9位[6]。国内恶性淋巴瘤发病率和病死率分别居所有恶性肿瘤的第11位和第7位[7]。恶性淋巴瘤可见于任何年龄组，好发于全身各处，但以原发淋巴结为多，结外发病以胃肠道为多[2,8]。恶性淋巴瘤由分化程度不同的淋巴细胞、组织细胞和网状细胞组成，由于淋巴细胞的分类差异，以及与组织细胞和网状细胞的比例、分布和分化程度的差异造成了恶性淋巴瘤组织学形态的多样性，部分病例的诊断比较困难。免疫组织化学染色阳性对于鉴别恶性淋巴瘤各亚型以及与其他增殖性疾病有一定的帮助，不能总是有效地辅助诊断恶性淋巴瘤[9]。

研究[9-11]表明弥漫大B细胞淋巴瘤中BCL-6基因重排，滤泡性淋巴瘤中BCL-2基因重排，黏膜相关性淋巴组织淋巴瘤中MALT1基因重排，套细胞淋巴瘤中CCND1基因重排，Burkitt淋巴瘤中C-MYC基因重排，间变性大细胞淋巴瘤中ALK基因重排这些遗传学异常可以作为判断恶性淋巴瘤亚型的重要依据。 FISH是利用荧光标记的核酸分子作为探针，经变性解链后，在适当条件下与细胞内互补的核酸分子杂交，从而检测后者存在的情况以及数量、结构等变化的一种方法。运用FISH方法，弥漫大B细胞淋巴瘤中BCL-6基因重排阳性率为29.03%(9/31)，滤泡性淋巴瘤中BCL-2基因重排阳性率为61.11%(11/18)，黏膜相关性淋巴组织淋巴瘤中MALT1基因重排阳性率为47.37%(9/19)，套细胞淋巴瘤中CCND1基因重排阳性率为88.88%(8/9)，Burkitt淋巴瘤中C-MYC基因重排阳性率为100%(2/2)，间变性大细胞淋巴瘤中ALK基因重排阳性率为75.00%(6/8)。因此，对于不典型或特殊的恶性淋巴瘤，运用FISH方法大部分能够得到确诊。

综上所述，恶性淋巴瘤因为种类繁多、分类庞大，临床病史、形态学及免疫组化结合遗传学特征具有重要诊断价值。

(本文图1～6见封三)

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Genetic status analysis of 87 cases in malignant lymphoma diagnosis fluorescence in situ hybridization

ShenXiaoying1,QiDongdong2,WuXinrui1,QuYue3,ZhangLiying4,ZhangYuping5,XuChunwei6,WuJihua1.

1.DepartmentofPathology, 306HospitalofPLA,Beijing100101，China. 2.DepartmentofOncology,ZhongshanHospital,DalianUniversity,Dalian116001，China. 3.BeijingXinjiYongkangGeneScienceandTechnologyCo.,Ltd.,Beijing100085，China. 4.DepartmentofPathology,TheMilitaryGeneralHospitalofBeijingPLA,Beijing100700，China. 5.DepartmentofPathology,ThePeople'sHospitalofWeifang,Weifang,Shandong261041，China. 6.DepartmentofPathology,AffiliatedHospitalofAcademyofMilitaryMedicalScience,Beijing100071,China.

Objective To analyze the characteristics of gene rearrangement in malignant lymphoma. Methods A retrospective analysis of 87 cases of samples with malignant lymphoma, which were used to detect gene rearrangement by fluorescence in situ hybridization, and Subtypes of diffuse large B cell lymphoma with the BCL-6 gene rearrangement, follicular lymphoma with the BCL-2 gene rearrangement, the mucosa associated lymphoid tissue lymphoma with MALT1 gene rearrangement, mantle cell lymphoma with CCND1 gene rearrangement, Burkitt lymphoma with C-MYC gene rearrangement and anaplastic large cell lymphoma with ALK gene rearrangement, respectively. Results The positive rate of BCL-6 gene rearrangement was 29.03% (9/31) in diffuse large B cell lymphoma, the positive rate of BCL-2 gene rearrangement was 61.11% (11/18) in follicular lymphoma, the positive rate of MALT1 gene rearrangement was 47.37% (9/19) in mucosa associated lymphoid tissue lymphoma, the positive rate of CCND1 gene rearrangement was 88.88% (8/9) in mantle cell lymphoma, the positive rate of C-MYC gene rearrangement was 100% (2/2) in Burkitt lymphoma and the positive rate of ALK gene rearrangement was 75.00% (6/8) in anaplastic large cell lymphoma. Conclusion Gene rearrangement has an important practical value to the diagnosis of malignant lymphoma.

Lymphoma； BCL-6 gene； BCL-2 gene； MALT1 gene； CCND1 gene； C-MYC gene； ALK gene

R733.1

A

1000-744X(2016)11-1126-03

2016-04-18)

△☆通信作者，△E-mail：xuchunweibbb@163.com；☆E-mail：jh_02821@126.com