芹菜素对氧嗪酸钾盐致高尿酸血症小鼠的降尿酸及肾保护作用机制研究Δ

缪明星，王 星，陆 琰，王 欣（.中国药科大学药学院，南京 0009；.南京大学医学院附属鼓楼医院药剂科，南京 0008）

芹菜素对氧嗪酸钾盐致高尿酸血症小鼠的降尿酸及肾保护作用机制研究Δ

缪明星1＊，王 星1，陆 琰1，王 欣2（#1.中国药科大学药学院，南京 210009；2.南京大学医学院附属鼓楼医院药剂科，南京 210008）

目的：研究芹菜素对氧嗪酸钾盐致高尿酸血症小鼠的降尿酸及肾保护作用机制。方法：将50只小鼠按体质量随机分为正常组、模型组、别嘌呤醇组（5 mg/kg）与芹菜素低、高剂量组（40、80 mg/kg），每组10只。除正常组外，其余各组小鼠ig氧嗪酸钾250 mg/kg复制高尿酸血症模型，造模后1 h，各给药组小鼠ig相应药物，正常组和模型组小鼠ig等体积生理盐水，每天1次，连续7 d。测定各组小鼠血尿酸、尿尿酸、24 h尿肌酐水平和肾脏转运体相关蛋白（mURAT1、mOCT1、mOCT2、mOCTN1、mOCTN2）表达水平。结果：与正常组比较，模型组小鼠血尿酸、尿尿酸、mURAT1水平显著升高，mOCT1、mOCT2、mOCTN1、mOCTN2水平和24 h尿肌酐水平显著降低（P＜0.01或P＜0.001）；与模型组比较，芹菜素低、高剂量组及别嘌呤醇组小鼠血尿酸、尿尿酸、mURAT1水平显著降低，24 h尿肌酐水平、mOCT1、mOCT2、mOCTN1和mOCTN2水平显著升高（P＜0.05或P＜0.01或P＜0.001）。结论：芹菜素能降低氧嗪酸钾盐致高尿酸血症小鼠的尿酸水平，保护肾脏；其作用机制可能与下调小鼠肾脏中mURAT1水平，上调mOCTN1、mOCTN2、mOCT1及mOCT2水平相关。

芹菜素；高尿酸血症；肾保护作用；肾脏转运体相关蛋白；机制；小鼠

高尿酸血症是一种严重危害人类健康的代谢性疾病，可造成肾功能不全。高尿酸血症与痛风、高血压、肾脏疾病及代谢综合征有关[1-2]，其标志是肾脏尿酸盐分泌功能受损[3]。目前有文献报道肾脏阴离子转运子，如尿酸盐转运子1（URAT1，编码为SLC22A12），在肾脏中介导尿酸盐的转运[4]。因此，高尿酸血症药物作用的靶点与肾脏有机离子转运子有关[5-6]。

芹菜中含有大量芹菜素，前期研究表明芹菜素可以降低高尿酸血症小鼠血清尿酸水平[7]。还有研究报道芹菜素对氧嗪酸盐诱导的高尿酸血症大鼠具有促尿酸排泄功能[8]。芹菜素对肝脏黄嘌呤氧化酶（XOD）活性的抑制作用与别嘌呤醇相比不足以逆转高尿酸血症小鼠的尿酸水平，表明芹菜素可能是通过其他途径调控肾脏尿酸盐转运的。目前关于芹菜素对氧嗪酸钾致小鼠高尿酸血症的降尿酸及肾保护作用机制研究尚不是很清楚，而小鼠肾脏尿酸盐转运系统和人比较相似[9]。因此，在本研究中笔者ig氧嗪酸钾以复制高尿酸血症小鼠模型，给药后评价芹菜素降尿酸活性，同时研究其与mURAT1、mOCT1、mOCT2、mOCTN1和mOCTN2等尿酸盐转运蛋白表达水平的相关性，为芹菜素的进一步研究提供实验依据。

1 材料

1.1 仪器

XHF-D高速分散器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；5810R高速冷冻离心机（德国Eppendrof公司）；754紫外-可见分光光度计（上海菁华科学仪器有限公司）；7500实时定量荧光聚合酶链反应（PCR）仪（美国ABI公司）、ChemiDoc XRS化学发光成像系统（美国Bio-Rad公司）。

1.2 试剂

芹菜素（陕西慧科植物开发有限公司，批号：Ap20010124，纯度：≥98%）；别嘌呤醇（批号：13053006，规格：25 g，含量：98%）、氧嗪酸钾（批号：12042001，规格：25 g，纯度：98%）均购自德国Sigma公司；尿酸测定试剂盒（南京拜傲斯生物科技有限公司，货号：700320）；肌酐测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：201401622）；Trizol RNA提取试剂盒、反转录试剂盒（美国Invitrogen公司，货号：15596026、18080051）；小鼠mOCT1、mOCT2兔源单克隆抗体（美国Thermo Scientific公司，货号：PA528209、PA532526）；小鼠mOCTN1、mOCTN2兔源单克隆抗体（美国Santacruze公司，货号：SC-19819、SC-19822）；小鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶（mGAPDH）、mβ-actin单克隆抗体（上海百研生物科技有限公司，货号：E021010、E021020）；辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔免疫球蛋白（Ig）G（南京生兴生物技术有限公司，货号：ESN134）；其余试剂均为分析纯。

1.3 动物

KM小鼠50只，♂，体质量（20±2）g，上海斯莱克实验动物有限责任公司[合格证号：SCXK（沪）2007-0005]。饲养环境：照明12 h/d，环境温度（25±2）℃，湿度（55±5）%。

2 方法

2.1 分组、造模、给药与取样

将50只小鼠按体质量随机分为正常组、模型组、别嘌呤醇组（5 mg/kg）与芹菜素低、高剂量组（40、80 mg/kg），每组10只（剂量依据预实验及参考文献[8]确定）。除正常组外，其余各组小鼠ig氧嗪酸钾250 mg/kg以复制高尿酸血症模型。造模后1 h，各给药组小鼠ig相应药物，正常组和模型组小鼠ig等体积生理盐水，每天1次，连续7 d。末次给药后1 h，各组小鼠于眼球静脉丛取血，离心（离心半径为10 cm，3 000 r/min，下同）10 min，取血清，备用。之后脱颈椎处死小鼠，在冰台上取小鼠肝脏和肾组织，用液氮冷冻后置于－80℃冰箱保存，备用。

2.2 各组小鼠血尿酸、尿尿酸、24 h尿肌酐水平测定

给药第6 d，于给药1 h后每组取5只小鼠置于代谢笼内，适应1 d后，于给药第7 d收集24 h尿液。尿液离心10 min，取上清液，测量尿液体积，另取“2.1”项下血清，按试剂盒说明书方法操作分别测定各组小鼠血尿酸、尿尿酸、24 h尿肌酐水平。

2.3 各组小鼠肾脏转运体蛋白表达水平的测定

取肾脏皮质刷状缘膜（BBMV）蛋白测定mURAT1、mOCTN1、mOCTN2和mβ-actin的蛋白表达，取肾脏皮层蛋白测定mOCT1、mOCT2和mGAPDH的蛋白表达。按文献[10]的方法提取“2.1”项下小鼠肾组织中BBMV蛋白及肾脏皮层蛋白。采用考马斯亮蓝法测定BBMV和肾皮质上清中的蛋白含量，以牛血清蛋白为标准品。蛋白统一稀释后，在沸水中煮5 min备用。样品经12%的分离胶行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶电泳分离后，在300 mA条件下将蛋白转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上100 min，在5%脱脂奶粉封2 h后取出膜，刷状缘膜蛋白分别用mURAT1（1∶1 000，V/V，下同）、mOCTN1（1∶1 000）、mOCTN2（1∶1 000）一抗和内参mβ-actin（1∶1 000），肾脏皮层蛋白分别用mOCT1（1∶2 000）、mOCT2（1∶2 000）和内参mGAPDH（1∶5 000），在4℃条件下孵育过夜。磷酸盐-吐温缓冲液（PBST）洗膜后加入HRP标记的羊抗兔IgG二抗（1∶10 000），化学发光法显影。采用Chemi-Doc XRS凝胶成像系统进行信号扫描，测定条带灰度值，采用Quantity One 4.62软件进行定量分析，以目的基因与内参mβactin灰度值比值表示目的基因的相对表达水平。

2.4 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件对所得数据进行分析。所用数据采用±s表示，采用单因素方差分析，组间比较采用LSD法。P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组小鼠血尿酸、尿尿酸及24 h尿肌酐水平测定结果

与正常组比较，模型组小鼠血尿酸、尿尿酸水平显著升高，24 h尿肌酐水平显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，芹菜素低、高剂量组及别嘌呤醇组小鼠血尿酸、尿尿酸水平显著降低，24 h尿肌酐水平显著升高（P＜0.05或P＜0.01），详见表1。

表1 各组小鼠血尿酸、尿尿酸、24 h尿肌酐水平测定结果（±s，n＝10）Tab 1 Results of blood uric acid，urine uric acid and 24 h creatinine levels of mice in each grou（p±s，n＝10）

表1 各组小鼠血尿酸、尿尿酸、24 h尿肌酐水平测定结果（±s，n＝10）Tab 1 Results of blood uric acid，urine uric acid and 24 h creatinine levels of mice in each grou（p±s，n＝10）

注：与正常组比较，＊＊P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.normal group，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

组别正常组模型组芹菜素低剂量组芹菜素高剂量组别嘌呤醇组剂量，mg/kg 40 80 5血尿酸，mg/L 34.78±2.09 45.85±3.08＊＊35.29±4.27##30.57±4.02##18.38±2.44##尿尿酸，mg/L 0.95±0.08 1.26±0.07＊＊1.08±0.05##0.96±0.08##1.03±0.09##24 h尿肌酐，mg/dl 24.19±1.46 17.13±1.26＊＊23.44±2.01##25.82±1.97##19.99±1.28#

3.2 各组小鼠肾脏转运体相关蛋白表达水平的测定

与正常组比较，模型组小鼠mURAT1水平显著升高，mOCT1、mOCT2、mOCTN1、mOCTN2水平显著降低（P＜0.001）；与模型组比较，芹菜素低、高剂量组、别嘌醇组小鼠mURAT1水平显著降低，mOCT1、mOCT2、mOCTN1和mOCTN2水平显著升高（P＜0.05或P＜0.01或P＜0.001），详见图1、图2。

图1 各组小鼠肾脏尿酸转运体相关蛋白水平测定电泳图Fig 1 Electrophoretogram for the determination of renal uric acid transporter related protein of mice in each group

图2 各组小鼠肾脏尿酸转运体相关蛋白表达测定结果注：与正常组比较，＊＊＊P＜0.001；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001Fig 2 The expression of kidney transporter associated protein in mice in each groupNote：vs.normal group，＊＊＊P＜0.001；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001

4 讨论

芹菜素具有促尿酸排泄、改善肾功能的作用，具体表现为其可显著降低高尿酸血症小鼠血尿酸、尿尿酸水平。食物和细胞中若含有大量的嘌呤类化合物，则伴随着尿液尿酸盐水平的上升，可能会导致患者体内血清尿酸盐水平的升高，由于人缺乏尿酸酶无法将尿酸降解成尿囊素，故尿酸是人体内嘌呤代谢的终产物。目前有研究显示连续ig芹菜素7 d可明显降低小鼠24 h尿尿酸水平[11]。本研究结果表明，芹菜素低、高剂量及别嘌呤醇均可显著降低高尿酸血症小鼠的血尿酸、尿尿酸水平，同时显著升高24 h尿肌酐水平。

芹菜素还可能通过其他机制降尿酸以保护肾功能。肾脏有机离子转运子对尿酸盐转运及改善肾功能发挥着重要作用。目前已有研究证实氧嗪酸钾诱导的高尿酸血症大鼠肾脏组织有机阴离子转运蛋白1（rOAT1）的mRNA和蛋白表达同时降低[12]。同时芹菜素可以改善四氧嘧啶造成的糖尿病小鼠肾功能异常从而发挥其肾保护作用，这可能与芹菜素调节肾脏尿酸转运体的作用相关[13]。本研究表明，芹菜素对氧嗪酸钾盐致小鼠高尿酸血症具有明显的改善作用，其作用机制可能与下调高尿酸血症小鼠肾脏mURAT1水平的表达，降低肾脏尿酸盐重吸收能力，以及上调肾脏mOCT1、mOCT2、mOCTN1和mOCTN2表达水平相关。

综上所述，本研究证实芹菜素是防治小鼠高尿酸血症合并肾功能不全的一种潜在药物，这为研究芹菜素降尿酸活性及肾功保护机制提供了新思路。

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Mechanism Study on Effects of Apigenin on Reducing Uric Acid and Renal Protection in Oteracil Potassium-induced Hyperuricemia Mice

MIAO Mingxing1，WANG Xing1，LU Yan1，WANG Xin2（1.School of Pharmacy，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China；2.Dept.of Pharmacy，the Affiliated Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical School，Nanjing 210008，China）

OBJECTIVE：To investigate the mechanism of the effects of apigenin on reducing uric acid and renal protection in oteracil potassium-induced hyperuricemia mice.METHODS：50 mice were randomly divided into normal group，model group，allopurinol group（5 mg/kg），apigenin low-dose and high-dose groups（40，80 mg/kg），with 10 mice in each group.Except for normal group，other groups were given oteracil potassium 250 mg/kg intragastrically to induce hyperuricemia model；1 h after modeling，treatment groups were given relevant medicine intragastrically，and normal group and model group were given constant volume of normal saline intragastrically，once a day，for consecutive 7 d.Blood uric acid，urine uric acid and 24 h creatinine levels，the expression of kidney transporter associated protein（mURAT1，mOCT1，mOCT2，mOCTN1 and mOCTN2）were all determined in each group.RESULTS：Compared with normal group，blood uric acid，urine uric acid and mURAT1 levels of model group were significantly increased，while the expressions of mOCT1，mOCT2，mOCTN1 and mOCTN2，24 h creatinine were significantly decreased（P＜0.01 or P＜0.001）.Compared with model group，blood uric acid，urine uric acid and mURAT1 levels of apigenin low-dose and high-dose groups，allopurinol group were significantly decreased，while 24 h creatinine，the expressions of mOCT1，mOCT2，mOCTN1 and mOCTN2 were increased significantly（P＜0.05 or P＜0.01 or P＜0.001）.CONCLUSIONS：Apigenin can reduce uric acid level of oteracil potassium-induced hyperuricemia mice and propect kidney，the mechanism of which may be associated with down-regulating the expression of mURAT1 and up-regulating the expressions of mOCTN1，mOCTN2，mOCT1 and mOCT2.

Apigenin；Hyperuricemia；Renal protection；Kidney transporter associated protein；Mechanism；Mice

R966

A

1001-0408（2016）34-4794-04

2016-06-13

2016-09-18）

（编辑：刘明伟）

中国药科大学中央高校基本科研业务费项目（No. ZJ16197）

＊讲师，硕士。研究方向：药动学。电话：025-86185307。E-mail：mmx0224@cpu.edu.cn

#通信作者：主管药师。研究方向：药理学与药房管理。电话：025-83304616。E-mail：20031269@qq.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.34.13