电针对多囊卵巢综合征模型大鼠糖、脂代谢紊乱的影响*

李 威,张益蒴,匡洪影△,冯文婷

(1.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040;2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040;3.山西省太原市第三人民医院，山西 太原 030000)



电针对多囊卵巢综合征模型大鼠糖、脂代谢紊乱的影响*

李 威1,张益蒴2,匡洪影1△,冯文婷3

(1.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040;2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040;3.山西省太原市第三人民医院，山西 太原 030000)

目的：探讨电针治疗对糖、脂代谢紊乱型多囊卵巢综合征(PCOS)模型大鼠的疗效及影响。方法：24日龄SD大鼠随机分组为空白对照组、PCOS模型组、电针治疗组，分组后使用雄激素脱氢表雄酮(DHEA)颈背部注射进行造模。采用HE染色法、酶联免疫吸附测定法、实时PCR和WESTENBLOT蛋白印迹进行检测并观察结果。结果：经电针治疗后卵巢多囊状态得到了改善；电针使血清激素LH/FSH比值下降，全身血清脂代谢HLD-C、TG、CHO均降低，LDL升高；电针治疗后PCOS模型大鼠卵巢局部GLUT1、GLUT4mRNA的表达和蛋白水平明显升高。结论：电针能够调节PCOS模型大鼠全身糖、脂代谢和卵巢局部GLUT1、GLUT4的mRNA表达量和蛋白的含量。

电针;多囊卵巢综合征;糖、脂代谢

多囊卵巢综合征(PolycysticOvarySyndrome,PCOS)，是一类异质性内分泌失调性疾病，其发病原因与神经内分泌、脂质代谢、葡萄糖代谢及蛋白质代谢等多因素相关。PCOS的临床表现主要为月经功能紊乱和高雄激素血症，具体表现包括月经失调、不孕、多毛、痤疮、肥胖等代谢异常特征。同时PCOS患者患2型糖尿病的风险和心血管疾病风险的发生率显著提高[1]。胰岛素抵抗和糖、脂代谢功能障碍存在于雌性PCOS大鼠。此外，存在于卵巢局部组织的异常胰岛素信号传导途径，可能与调节胰岛素信号传导分子的蛋白表达相关[2]。近年来，糖、脂代谢紊乱存在于PCOS患者中，针刺作为传统中医学的一部分，应用涉及很多领域[3]。

电针(Electroacupuncture,EA)作为一种替代疗法得到了广泛的认可，研究发现电针刺激是一种有前途、有疗效的治疗多囊卵巢综合征(PCOS)的方法，为治疗多囊卵巢综合征提供了重要临床经验，增加了知识基础[4]。研究表明针刺治疗多囊卵巢综合征的疗效较好[5]。针刺治疗PCOS具有一定优势，与目前处方药物治疗、手术治疗和生活方式相比较，可降低费用及多胎妊娠的风险[6]。同时针刺治疗可适度改善PCOS女性抑郁和焦虑评分，提高相关健康生活质量分数[7]。

针刺治疗多囊卵巢综合征有效，但尚不完全明确，证据水平也相对较低,需要更多的高质量的证据。本实验研究宗旨在于探讨电针对于PCOS模型大鼠GLUT1和GLUT4基因表达量的差异，从而为电针对多囊卵巢综合征中糖、脂代谢异常型改变提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

21只正常SD健康，清洁级，雌性大鼠(黑龙江中医药大学动物实验中心提供)，体质量(50±5)g，21日龄大小，适应性喂养2天饲养在黑龙江中医药大学妇科药理实验室。于24日后随机分组。随机分为空白对照组(CON)、PCOS模型组(PCOS)和电针治疗组(EA)。

1.2PCOS模型大鼠的构建与评定

构建：随机分组后PCOS模型组和电针治疗组大鼠每日用脱氢表雄酮(DHEA，北京百灵威科技有限公司)60mg/100g体重溶于0.2ml注射药用级大豆油(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)中，经由大鼠颈背部皮下注射，空白对照组的大鼠，作为对照每日注射0.2ml注射药用级大豆油，连续注射21日。

评定：造模后每日上午8:00～9:00阴道涂片，然后直接在普通显微镜下观看细胞的形态，观察大鼠的动情周期变化。参照施新猷主编的《现代医学实验动物学》标准：动情前期、动情期、动情后期、动情间期。观察出现连续的动情周期紊乱说明造模成功。

1.3 电针针刺治疗

电针治疗组大鼠于造模21日后进行针刺治疗，选取穴位参照大鼠标准穴位图谱，具体选穴为：子宫、中极、关元和三阴交穴。1次/天，5天/周，连续4～5周电针刺激治疗。电针针刺治疗的第1周15min/次，第2、3周20min/次，第4、5周25min/次。大鼠被固定后，按腧穴定位针刺，针柄连接低频电针治疗仪，连续波，2Hz电流输出，以大鼠局部肌肉轻度抖动而不产生挣扎为度，一对导线接同侧两个穴位。

空白对照组与PCOS模型组大鼠只固定不做任何针刺处理。

1.4 标本制备

组织标本保存：治疗结束禁食12h后，将处于动情期的大鼠眼眶迅速取血，静置1h后3500Rpm分离血清，-70℃冰箱保存备用；双侧卵巢经称重后去除表面脂肪组织，一侧卵巢组织固定于10%中性福尔马林液中，切片后进行HE染色，剩余组织置于-70℃冰箱保存。

1.5 检测方法

血清学检测：血清激素FSH、LH等的检测采用酶联免疫吸附法检测(试剂盒购自由武汉云克隆科技股份有限公司)。脂代谢指标由黑龙江中医药大学附属第一医院检验科生化组采用酶法测定。

实时荧光定量RT-PCR(quantitativereal-timePCR)法检测卵巢组织中GLUT1及GLUT4的表达水平，实时荧光试剂选用美国ThermoScientific的BRGreenqpcrMasterMix(2x)ROXsolution，按照试剂盒说明进行操作。引物序列参照NCBI基因库的基因序列来设计引物，该实验扩增片段长度为100～250bp，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

WESTENBLOT蛋白印迹(westernblot)：冷冻保存卵巢组织加入蛋白裂解液后充分破碎，而后12000rpm离心10mins后取上清进行定量。蛋白样品加buffer上样，经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后将蛋白转印至PVDF膜上采用相应的一抗及对应的辣根过氧化物酶标记的二抗进行孵育。孵育完成并充分洗脱后，采用放射自显影的方法检测目的条带化学发光强度。

1.6 统计学方法

全部数据使用SPSS19.0软件系统统计和数据分析，行正态性分布检验后，使用单因素ANOVA均值比较，其中方差齐者使用Bonferroni(B)检验，不符合者采用Dunnett’sT3(3)检验，以P<0.05为检验水准有统计学意义，表示组间具有显著差异性。

2 结果

2.1 卵巢切片HE染色

由封三彩图1可见，空白对照组为正常发育的卵巢卵泡和卵泡颗粒细胞；PCOS模型组为多囊样改变，包括囊性扩大的卵巢滤泡，黄体与颗粒细胞层数减少；电针治疗组与PCOS模型组相比黄体颗粒细胞层数增加。

2.2 血清激素水平检测

表1 血清激素FSH与LH及LH/FSH水平

由表1可见，PCOS组与CON组相比较，LH/FSH比值上升，与EA组相比较，LH/FSH比值下降。在血清激素水平上，电针治疗组血清激素FSH有所升高，LH有所下降，LH/FSH也有所降低，但未发现组间统计学差异。

2.3 糖脂代谢指标

表2 全身血清脂代谢水平的变化

注：与CON比较，*P<0.05；与PCOS比较，#P<0.05

由表2可见，PCOS模型组较空白对照组，高低密度脂蛋白、甘油三酯、胆固醇方面均升高(P<0.05)，针刺治疗后高低密度脂蛋白、甘油三酯、胆固醇方面均下降(P<0.05)。

2.4 实时PCR卵巢局部mRNA表达量的差异

由表3可见，PCOS模型组大鼠卵巢局部GLUT1、GLUT4的mRNA表达量升高(P<0.05)，电针治疗组大鼠卵巢局部GLUT1、GLUT4的mRNA表达量明显下降(P<0.05)。

表3 卵巢中GLUT1和GLUT4的mRNA表达差异

注：与CON比较，*P<0.05；与PCOS比较，#P<0.05

2.5Western-blot中卵巢局部GLUT1与GLUT4的蛋白表达水平

图2 卵巢局部GLUT1、GLUT4的蛋白表达水平

由图2可见，PCOS模型组大鼠卵巢局部GLUT1、GLUT4蛋白水平下降，电针治疗组大鼠经过针刺治疗后卵巢局部GLUT1、GLUT4蛋白水平明显升高。但组间比较P>0.05,组间没有明显统计学差异。

3 讨论

代谢综合征(Metabolicsyndrome，MS) 是一组复杂的代谢紊乱症候群，主要是指体内糖类、脂肪、蛋白质这三大营养物质或其他多种物质发生异常代谢的病理状态。其中PCOS患者最为常见,表现多为糖、脂代谢紊乱[8]。PCOS患者中糖代谢紊乱表现为胰岛素抵抗和卵巢局部糖代谢异常；脂代谢紊乱常表现为全血脂代谢异常(TC、TG、LDL-C的水平升高，而HDL-C的水平降低)。

自针刺开始应用于PCOS的治疗，疗效显著，临床上针刺治疗PCOS收到了很好的疗效[9]。研究证明针刺在改善PCOS患者的内分泌和代谢紊乱、促排卵和胰岛素抵抗等方面都具有良好作用[10]。针刺是通过激活感觉传入神经，进而调节卵巢局部和中枢神经系统的交感神经活动[11]。针刺治疗PCOS的理论机制是通过其自主神经系统起作用，针刺使卵巢局部交感标记物的表达和卵巢交感神经反射应答[12]。本实验探讨了针刺对PCOS治疗机制的进一步研究。

本实验选用电针针刺，从根本上调节糖、脂代谢紊乱型多囊卵巢综合征。研究结果显示，电针针刺治疗后PCOS模型大鼠卵巢的排卵情况得到了恢复，卵巢多囊改变减少，包括卵巢卵泡，卵泡颗粒细胞较黄体颗粒细胞层数增加；在血清激素水平上，针刺治疗后血清激素FSH有所升高，LH有所下降，LH/FSH也有明显变动；全血脂代谢水平上，电针针刺治疗后PCOS模型大鼠的高密度脂蛋白、甘油三酯、胆固醇方面均有所升高；卵巢局部基因表达和蛋白含量水平上，电针针刺治疗后PCOS模型大鼠卵巢局部GLUT1、GLUT4的mRNA表达量和蛋白水平明显升高。

葡萄糖转运蛋白(GLUTs)是介导哺乳动物细胞葡萄糖转运的主要载体，其中GLUT1(glucosetransporter1)是目前已知体内分布最为广泛的葡萄糖转运体，GLUT1作为机体分布最广泛的葡萄糖转运体，不仅与机体糖代谢疾病有关，同时与卵巢分泌的性激素有关，尤其是雌激素[13]。GLUT4 (glucosetransporter4)是循环系统转移的主要转运体，是维持机体葡萄糖稳态的关键因素；主要负责各类细胞的基础糖代谢需求。GLUT4能在胰岛素的刺激下，通过易位作用将葡萄糖转运到细胞膜上，促进葡萄糖的摄取和代谢，GLUT4与胰岛素抵抗(insulinresistance,IR)密切相关[14]；同时女性卵巢局部分泌的雌激素也可以调节GLUT4的水平。近几年的研究中发现，在仓鼠卵巢细胞系中特异性激活ERβ可增加GLUT4表达，雌激素刺激对于GLUT4的相关表达影响存在矛盾性[15],说明GLUT4在mRNA的表达量和蛋白质水平均可检测。

糖、脂代谢紊乱可能对PCOS疾病的发生具有重要推动作用。电针针刺可以明显的增加胰岛素分泌，达到降糖作用。这些研究均表明[16-18]，电刺针刺刺激穴位可增加胰岛素分泌，降低糖代谢水平；同样，ShapiraMY等[19]的研究结果发现，改善胰岛素抵抗降低糖尿病动物模型血糖可通过重复电针穴位时间达到。虽然PCOS病因尚未完全阐明，越来越多的研究表明胰岛素抵抗IR是其发病的中心环节，糖脂代谢紊乱均可引起IR，胰岛素抵抗可能是PCOS发生的主要病理基础,但也有研究持不同的观点。胰岛素抵抗主要是因机体糖代谢紊乱和脂代谢紊乱造成的。

综上所述，电针针刺治疗对糖脂代谢紊乱型多囊卵巢综合征改善了卵巢多囊的形态、全血脂代谢、卵巢局部GLUT1、GLUT4mRNA的表达和蛋白的含量，由此可见，电针刺激可调节PCOS大鼠糖脂代谢紊乱，对于电针治疗多囊卵巢综合征胰岛素抵抗相关指标和作用机制还有待进一步深入研究。

[1]StephenFranksF,HardyK,DumesicDA,etal.PolycysticOvarySyndrome[J].Obstetrics&Gynecology,2004,103(1):181-93

[2] 梁晨，丛晶，常惠，等.补肾化痰复方对多囊卵巢综合征模型大鼠卵巢内胰岛素信号传导分子的调控[J].中国中西医结合杂志，2011,31(12):1639-1644

[3] 彭艳,李琴华,吴效科,等.电针对多囊卵巢综合征模型系统的调控[J].科技导报,2008,26(12):34-42

[4]BillhultA,StenervictorinE.Acupuncturewithmanualandlowfrequencyelectricalstimulationasexperiencedbywomenwithpolycysticovarysyndrome:aqualitativestudy[J].BmcComplementary&AlternativeMedicine,2012,12(12):1-6

[5]MaH,QuanX,LiJ,etal.Acupunctureforpolycysticovarysyndrome:Asystematicreviewandmeta-analysis[C]//IEEEWorkshoponElectronics,ComputerandApplications,2014:800-804

[6]LimDC,XueCC,WongFW,etal.Acupunctureforpolycysticovariansyndrome[J].CochraneDatabaseofSystematicReviews,2011,66(8):CD007689-CD007689

[7]Stener-VictorinE,HolmG,JansonPO,etal.Acupunctureandphysicalexerciseforaffectivesymptomsandhealth-relatedqualityoflifeinpolycysticovarysyndrome:secondaryanalysisfromarandomizedcontrolledtrial[J].BmcComplementary&AlternativeMedicine,2013,13(3):413-416

[8]BoyleJA，CunninqhamJ，NormanRJ，etal.PolycysticovarysyndromeandmetabolicsyndromeinIndigenousAustralianwomen[J].InternMedJ，2015，45(12)：1247-1254

[9] 杨新鸣,于慧佳,付冬雪,等.PCOS病证结合动物模型及针刺干预机制的研究进展[J].中医药学报,2016,44(4):101-103

[10]Stener-VictorinE,JedelE,MannerasL.Acupunctureinpolycysticovarysyndrome:currentexperimentalandclinicalevidence[J].JNeuroendocrinology,2008,20(3):290-298

[11]LindeK,StrengA,JürgensS,etal.AcupunctureforPatientsWithMigraine[J].JournaloftheAmericanMedicalAssociation,2005(17):2118-2125

[12]EnblomA,LekanderM,HammarM,etal.Gettingthegriponnonspecifictreatmenteffects:emesisinpatientsrandomizedtoacupunctureorshamcomparedtopatientsreceivingstandardcare[J].PlosOne,2011,6(3):e14766-e14766

[13]Rivenzon-SegalD，Boldin-AdamskyS，SegerD，etal．Glycolysisandglucosetransporter1asmarkersofresponsetohormonaltherapyinbreastcancer[J]．InternationalJournalofCancer，2003，107(2):177-182

[14]Fernandez-VeledoS,HernandezR,TeruelT,etal.CeramidemediatesTNF-alpha-inducedinsulinresistanceonGLUT4geneexpressioninbrownadipocytes[J].ArchPhysiolBiochem,2006,112(1):13-22

[15]LinZ，ShenH，HuangJ，etal．Butyl4-(butyryloxy)benzoatefunctionsasanewselectiveestrogenreceptorbetaagonistandinducesGLUT4expressioninCHO-K1cells[J]．JSteroidBiochemMolBiol，2008，110(1-2):150-156

[16]LinJG，ChangSL，ChengJT．Releaseofβ-endorphinfromadrenalglandtolowerplasmaglucosebyelectroacupunctureatZhongwanacupointinrats[J]．NeurosciLett，2002，326(1):17-20

[17]LinJG，ChenWC，HsiehCL．Multiplesourcesofendogenousopioidpeptideinvolvedinthehypoglycemicresponseto15HzelectroacupunctureatZhongwanacupointinrats[J]．NeurosciLett，2004，366(1):39-42

[18]ChangSL，TsaiCC，LinJG，etal．Involvementofserotonininthehypoglycemicresponseto2HzelectroacupunctureofZusanliacupoint(ST36)inrats[J]．NeurosciLett，2005，379(1):69-73

[19]ShapiraMY，AppelbaumEY，HirshbergB，etal．Asustained，non-insulinrelated，hypoglycaemiceffectofelectroacupunctureindiabeticPsammomysobesus[J]．Diabetologia，2000，43(60):809-813

国家自然科学基金项目,编号：81503610；黑龙江博士后基金项目，编号：061081;哈尔滨市科技创新人才研究专项资金项目,编号：RC2015QN003092。

李威(1979-)，男，副研究员，研究方向：生殖内分泌代谢。

△通讯作者：匡洪影(1981-)，女，博士后，副主任医师，研究方向：中医妇科临床及科研。

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2016-07-17