壳聚糖絮凝法精制补肾养血颗粒水提液的工艺研究

杜艳娇，康琛，杜茂波，沈硕，李曼玲，梁丽娜，刘淑芝

1.江西中医药大学，江西 南昌 330004；2.中国中医科学院中药研究所，北京 100700；3.中国中医科学院眼科医院，北京 100040

壳聚糖絮凝法精制补肾养血颗粒水提液的工艺研究

杜艳娇1，2，康琛2，杜茂波2，沈硕2，李曼玲2，梁丽娜3，刘淑芝2

1.江西中医药大学，江西 南昌 330004；2.中国中医科学院中药研究所，北京 100700；3.中国中医科学院眼科医院，北京 100040

目的 优选壳聚糖精制补肾养血颗粒水提液的工艺。方法 以淫羊藿苷为指标，应用高效液相色谱法测定其含量，采用正交设计法考察加水量、提取时间、提取次数对水提工艺的影响；以淫羊藿苷为指标，结合总多糖含量，选择药液浓度、絮凝温度、澄清剂加入量3个因素，优选壳聚糖的絮凝澄清条件。结果 最佳水提工艺条件为A2B1C3，即加入10倍量水，提取3次，每次1 h；最佳絮凝工艺为A1B2C3，即药液浓度为0.4 g/mL，絮凝温度为40 ℃，壳聚糖加入量为0.1%。结论 本研究优选的精制工艺稳定可行。

补肾养血颗粒；淫羊藿苷；壳聚糖；精制工艺；正交试验

补肾养血颗粒由枸杞子、淫羊藿、当归、黄芪、石斛等药材组成，是中国中医科学院眼科医院庄曾渊研究员的临床经验方，具有补肾益精、养血明目功效，眼科临床常用于治疗视网膜色素变性、年龄相关性黄斑变性等疾病。壳聚糖是甲壳素N-脱乙酰基后的衍生物，性质稳定，具有良好的生物可降解性和相容性，毒性极小且来源广泛，是自然界罕见的带正电荷纤维结构化合物，不溶于水和碱溶液，但可溶于稀酸。利用壳聚糖的电荷和大分子架桥的作用，在中药水提取液中加入一定量的壳聚糖，吸附和絮凝去除溶液中的不溶性颗粒和鞣质、蛋白质、树脂等杂质，得到澄清的溶液，在中药复方精制工艺中得到广泛应用。与醇沉法相比，能耗小，成本低，能够保留大部分多糖等有效成分，作为中药水提液澄清剂具有良好的应用前景[1]。因此，本研究以淫羊藿苷含量为指标，优选补肾养血颗粒壳聚糖澄清法精制工艺。

1 仪器与试药

Waters Alliance高效液相色谱仪（美国Waters公司），1515型检测泵，2487型检测器，717型自动进样器；BP211D型十万分之一电子天平，BSS210型万分之一电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）；Agilent 8453E型紫外分光光度计；DZKW-4型电子恒温水浴锅（北京中兴伟业仪器有限公司）；HJ-6型六联磁力加热搅拌器（金坛市万华实验仪器厂）。

淫羊藿苷对照品（批号0737-9508，中国食品药品检定研究院，供含量测定用），无水葡萄糖（批号991122，北京化学试剂公司），苯酚（批号030805，北京化学试剂公司），乙腈、甲醇为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，硫酸、乙醚均为分析纯。处方药材均购自安徽亳州芳益堂。壳聚糖为药用级（批号20131012，北京凤礼精求商贸有限责任公司），临用前用1%醋酸加热配成1%溶液[2]，放置24 h使其充分溶胀，备用。

2 方法与结果

2.1 淫羊藿苷含量测定

2.1.1 色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-水（28∶72）为流动相，流速1.0 mL/min，检测波长270 nm，柱温35 ℃，理论板数按淫羊藿苷峰计算应不低于1500。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取淫羊藿苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，即得。

2.1.3 供试品溶液的制备 取提取物干膏粉约0.2 g，精密称定，置塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇20 mL，密塞，称定质量，加热回流30 min，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，静置，取上清液，过滤，取续滤液，即得。

2.1.4 阴性对照溶液的制备 按处方比例分别称取除淫羊藿外的其余药味，按提取精制工艺制成缺淫羊藿的阴性样品，按“2.1.3”项下方法制成缺淫羊藿的阴性对照溶液。

2.1.5 线性关系考察 按“2.1.2”项下方法配制对照品溶液，按上述色谱条件，分别进样2、4、6、10、15、20 µL，记录淫羊藿苷峰面积，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程Y＝2.2×105X＋55 471（r＝0.999 7，n＝6），表明淫羊藿苷在0.2～2 µg与峰面积呈良好线性关系。

2.1.6 精密度试验 精密吸取同一对照品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件连续进样6次，每次10 µL，记录淫羊藿苷峰面积，结果淫羊藿苷峰面积RSD＝1.73%，表明仪器精密度良好。

2.1.7 重复性试验 取同一批样品，按“2.1.3”项下制备方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件，分别进样20 µL，记录淫羊藿苷峰的面积，结果淫羊藿苷平均含量为 1.218 mg/g原药材，RSD＝0.58%，表明该方法重复性良好。

2.1.8 稳定性试验 取同一供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件，分别在0、2、4、8、12、24 h进样20 µL，记录淫羊藿苷的峰面积，结果淫羊藿苷峰面积RSD＝0.98%，表明淫羊藿苷在24 h内稳定性良好。

2.1.9 空白试验 取阴性对照溶液，按“2.1.1”项下色谱条件，进样20 µL，记录色谱图（见图1）。结果表明，在淫羊藿苷的保留时间处无色谱蜂，说明对测定无干扰。

图1 补肾养血颗粒中淫羊藿苷HPLC图

2.1.10 加样回收率试验 精密称取已知含量的样品6份，各精密加入淫羊藿苷对照品，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件测定，结果见表1，表明本法具有良好的回收率。

表1 淫羊藿苷加样回收率试验

2.2 总多糖含量测定

2.2.1 对照品溶液的制备 取无水葡萄糖对照品25 mg，精密称定，置250 mL量瓶中，加适量水溶解，稀释至刻度，摇匀，即得（每1 mL中含无水葡萄糖0.1 mg）。

2.2.2 标准曲线的制备 精密量取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，分别置具塞试管中，分别加水补至2.0 mL，各精密加入5%苯酚溶液1 mL，摇匀，迅速精密加入硫酸5 mL，摇匀，放置10 min，置40 ℃水浴中保温15 min，取出，迅速冷却至室温，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法[2010年版《中华人民共和国药典》（一部）附录V A]，在490 nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y＝65.285X－0.052（r＝0.998 7），线性范围2.475～14.85 mg/L。

2.2.3 测定法 取本品粗粉约0.5 g，精密沉定，加乙醚100 mL，加热回流1 h，静置，放冷，小心弃去乙醚液，残渣连同滤纸置烧瓶中，加水150 mL，加热回流2 h。趁热过滤，用少量热水洗涤滤器，合并滤液与洗液，放冷，移至250 mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，精密量取1 mL，置具塞试管中，加水1.0 mL，按“2.2.2”项下方法，自“各精密加入5%苯酚溶液1 mL”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中葡萄糖质量，计算，即得。

2.3 水提工艺优化

根据浸提理论及查阅相关文献[3-6]，影响水提工艺的因素主要有加水量、提取时间、提取次数等，故本试验选取加水量（A）、提取时间（B）、提取次数（C）3个因素进行考察。按L9（34）正交表进行试验，按处方比例称取9份枸杞子等水提药材，每份共70 g，置圆底烧瓶中，加热回流，过滤，滤液经水浴浓缩，真空干燥，得干膏，称重，粉碎成干膏粉。以淫羊藿苷含量为考察指标，优选最佳水提工艺，因素水平见表2，试验安排及结果见表3，方差分析见表4。

由直观分析法可知，影响淫羊藿苷含量的主次顺序为C＞B＞A，即提取次数＞提取时间＞加水量，其中C因素是最主要因素；经方差分析可知，A因素和B因素对提取工艺均无显著影响（P＞0.05），C因素对提取工艺具有显著影响（P＜0.05），故确定最佳工艺为A2B1C3，即加10倍量水，提取3次，每次1 h。

2.4 絮凝工艺优化

根据相关文献[7-9]，影响壳聚糖纯化效果的因素主要有药液浓度、絮凝温度、壳聚糖加入量、药液的pH值、放置时间，絮凝搅拌速度等。本试验选取药液浓度（A）、絮凝温度（B）、壳聚糖加入量（C）3个因素，每个因素考察3个水平。称取处方药材540 g，置10000 mL圆底烧瓶中，按优选出的最佳水提工艺条件进行提取，即加入5400 mL水，加热回流提取3次，每次1 h，过180目筛，合并滤液，将滤液浓缩至一定浓度，离心，按正交试验设计安排将药液浓缩至0.4、0.2、0.1 g/mL的溶液，测定淫羊藿苷含量及总多糖含量。因素水平见表5，试验安排及结果见表6，方差分析见表7、表8。

表2 水提工艺正交试验因素水平表

表3 水提工艺正交试验安排及直观分析

表4 水提工艺方差分析

由直观分析法可知，RA＞RB＝RC，影响淫羊藿苷含量的主次顺序为A＞B＝C，即药液浓度＞絮凝温度＝壳聚糖加入量，其中A因素是最主要因素；经方差分析可知，A、B、C因素对絮凝工艺均无显著影响（P＞0.05），故最佳工艺为A2B2C3，即药液浓度为0.2 g/mL，絮凝温度为40 ℃，壳聚糖加入量为0.1%。

表5 絮凝工艺正交试验因素水平

表6 絮凝工艺正交试验安排及直观分析（mg/g原药材）

表7 淫羊霍苷含量方差分析

表8 总多糖含量方差分析

由直观分析可知，影响总多糖含量的主次顺序为A＞B＞C，即药液浓度＞絮凝温度＞壳聚糖加入量，其中A因素是最主要因素；经方差分析可知，A因素对絮凝工艺有显著影响（P＜0.05），故确定最佳工艺为A1B2C3，即浸膏浓度为0.4 g/mL，絮凝温度为40 ℃，壳聚糖加入量为0.1%。

综上分析，由于以淫羊藿苷为含量指标时，A因素对絮凝工艺无显著影响（P＞0.05），而考察总多糖含量时，A因素对絮凝工艺有显著影响（P＜0.05），故而最终确定最佳工艺为A1B2C3。

2.5 验证试验

按处方比例称取180 g水提药材，按最佳提取工艺提取，水提液平均分成3份，按优选的最佳絮凝工艺进行验证试验，结果见表9。说明该工艺稳定可行。

表9 验证试验结果

3 讨论

本试验在淫羊藿苷含量测定流动相选择时，考察了乙腈-水（30∶70）和乙腈-水（28∶72）2种比例，结果发现，流动相为乙腈-水（30∶70）时，阴性对照在淫羊藿苷保留时间处有干扰，而流动相为乙腈-水（28∶72）时无干扰。

壳聚糖澄清剂法虽然具有诸多优点，但目前技术尚不成熟，在精制过程中或多或少会有残留，虽然壳聚糖毒性低且具有良好的生物相容性，但其本身具有一定的药理功效[10-11]，尚需进一步探讨。中药复方水提液体系复杂，壳聚糖对水提液中各成分的影响亦有待进一步研究。

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Study on Refining Water Extract of Bushen Yangxue Granules by Chitosan Flocculation

DU Yan-jiao1,2, KANG Chen2, DU Mao-bo2, SHEN Shuo2, LI Man-ling2, LIANG Li-na3, LIU Shu-zhi2
(1. Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330004, China; 2. Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China; 3. Eye Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100040, China)

Objective To optimize refinement of water extract from Bushen Yangxue Granules by chitosan flocculation. Methods According to the content of icariin detected by HPLC, the waters amount, extraction time and extraction times were evaluated by orthogonal design. The effects of the solution concentration, clarifying temperature and the amount of clarifying agent on the flocculation clarification processes were optimized with the content of icariin and polysaccharides. Results The optimum water extraction processes A2B1C3were follows: 10 times amount of water, three times extraction and 1 h for each extraction process. The optimized flocculation clarification processes A1B2C3were as follows: solution concentration was 0.4 g/mL, the clarifying temperature was 40 ℃ and the addition of chitosan was 0.1%. Conclusion The optimized refining process is stable and feasible.

Bushen Yangxue Granules; icariin; chitosan; refining process; orthogonal test

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.04.026

R283.5

A

1005-5304(2016)04-0098-04

2015-08-26）

（

2015-09-11；编辑：陈静）

北京市中医药科技发展项目（JJ2013-67）

刘淑芝，E-mail：liushuzhi2004@sina.com；梁丽娜，E-mail：lianglina163@163.com