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不同强度运动联合中药对葡萄糖耐量减退大鼠血管内皮功能的影响

2016-12-21倪英群方朝晖

中国中医药信息杂志 2016年4期
关键词:降糖高强度内皮

倪英群,方朝晖

国家中医临床研究糖尿病基地,安徽中医药大学第一附属医院,安徽 合肥 230031

不同强度运动联合中药对葡萄糖耐量减退大鼠血管内皮功能的影响

倪英群,方朝晖

国家中医临床研究糖尿病基地,安徽中医药大学第一附属医院,安徽 合肥 230031

目的 观察不同强度运动联合中药对葡萄糖耐量减退(IGT)大鼠过氧化物酶体增殖活化受体γ辅助活化因子1α(PGC-1α)的表达及血管内皮功能的影响,探讨不同强度运动与中药联合的协同作用及其机制。方法 健康雄性SD大鼠70只,随机取10只为空白组予以常规饲料喂养,其余60只大鼠予以高糖高脂饲料喂养进行造模。将成模大鼠随机分为模型组、单纯中药组(中药组)、低强度运动+中药组(低强度组)、中强度运动+中药组(中强度组)、高强度运动+中药组(高强度组),每组10只。空白组、模型组、中药组每日自由活动,运动各组进行不同强度跑台运动,同时给予丹蛭降糖胶囊灌胃。比较干预前后一氧化氮(NO)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、血管性假血友病因子(vWF)和血浆内皮微粒(EMP)变化;检测各组PGC-1α水平。结果 与空白组比较,模型组NO、eNOS、PGC-1α水平下降,vWF、EMP水平升高(P<0.05);与模型组比较,各干预组NO、eNOS、PGC-1α水平升高,vWF、EMP水平降低(P<0.05,P<0.01)。结论 中等强度运动联合丹蛭降糖胶囊能有效改善血管内皮功能。

不同强度运动;葡萄糖耐量减退;过氧化物酶体增殖活化受体γ辅助活化因子1α;中药;大鼠

糖尿病是临床常见的内分泌代谢紊乱症,以血管内皮损伤为基础的并发症给患者带来诸多危害。有研究表明,在糖尿病早期糖耐量受损(IGT)阶段血管内皮功能就已处于失调状态[1-2]。过氧化物酶体增殖活化受体γ辅助活化因子1α(PGC-1α)在线粒体生物合成过程中起重要作用,影响细胞的能量代谢及细胞凋亡,在血管重建及胰岛素抵抗等方面具有调节作用。前期研究表明,运动联合丹蛭降糖胶囊可对抗氧化应激,改善胰岛功能[3]。本实验以IGT大鼠为研究对象,观察丹蛭降糖胶囊联合不同强度运动干预下PGC-1α的表达及血清一氧化氮(NO)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、血管性假血友病因子(vWF)水平、血浆内皮微粒(EMP)的变化,探讨其作用机制。

1 实验材料

1.1 动物

清洁级健康雄性SD大鼠70只,4~5周龄,体质量140~160 g,安徽中医药大学实验动物中心,合格证号SCXK(皖)2012-001。室温(23±2)℃、湿度40%~60%,昼夜明暗12 h/12 h交替,自由饮水,分笼饲养,适应性喂养1周。

1.2 药物

丹蛭降糖胶囊由太子参、生地黄、牡丹皮、菟丝子、泽泻、水蛭等组成,安徽中医药大学第一附属医院制剂室提供,批号20140526,每粒含原药材0.5 g。

1.3 主要试剂与仪器

NO、NOS测定试剂盒,南京建成生物工程研究所;vWF测定试剂盒,上海轩吴科技公司;EMP抗体,美国BCI公司;PGC-1α试剂盒,美国ADL公司。Teacan Infinite M200酶标仪、洗板机wellwash4MK-2(芬兰),流式细胞仪(美国BD公司),PCR仪(美国Bio-RAD),凝胶成像分析系统(美国SYNGENE)。

2 实验方法

2.1 造模和分组

适应性饲养1周后,随机选取10只为空白组,予以常规饲料(13.4 kJ/g)喂养,其余60只大鼠予以高糖高脂饲料(21.8 kJ/g)喂养。12周时行口服葡萄糖耐量试验(OGTT),禁食8 h鼠尾采血测空腹血糖(FBG),50%葡萄糖注射液2 g/kg灌胃,2 h后再次鼠尾采血测餐后2 h血糖(2 h PG),以7.8 mmol/L≤2 h PG<11.1 mmol/L并持续1周以上为IGT造模成功,实际成模50只。将成模大鼠随机分为模型组、单纯中药组(中药组)、低强度运动+中药组(低强度组)、中强度运动+中药组(中强度组)、高强度运动+中药组(高强度组),每组10只。由于高血糖、运动等原因造成实验中大鼠少量死亡及丢失,最终空白组10只、模型组8只、中药组9只、低强度组9只、中强度组10只、高强度组9只。

2.2 给药

空白组、模型组和中药组每日自由活动;中药组予丹蛭降糖药液灌胃,给药剂量按临床成人剂量的12倍即1.08 g/kg灌胃,每日1次;运动各组大鼠每日10 m/min×10 min适应性跑台训练。正式治疗开始后,负荷强度依据Bedford等[4]推荐,即低强度组跑速为10 m/min(约30%VO2max),坡度为0°;中强度组为15 m/min(约50%VO2max),初始跑速为12 m/min,持续30 min,坡度为0°,以后运动坡度为5°,每隔1 d速度增加1 m/min,运动时间增加10 min,直至增至15 m/min,时间为1 h;高强度组为20 m/min(约70%VO2max),初始跑速为15 m/min持续30 min,坡度为0°,以后运动坡度为5°,每隔1 d速度增加1 m/min,运动时间增加10 min,1周增至20 m/min,时间为1 h,或以大鼠在跑台上出现顽固性拒跑现象,则停止跑台运动。运动各组运动时间每周5 d,每日1次。其余时间自由活动,期间不改变膳食方案,同时予丹蛭降糖药液1.08 g/kg灌胃,每日1次。

2.3 观察指标

2.3.1 一氧化氮和血管性假血友病因子检测 第18周末干预结束后禁食12 h,10%水合氯醛0.5 mL/100 g大鼠腹腔注射麻醉,腹主动脉取血3 mL,室温静置1 h,3000 r/min离心20 min,分离血清后-80 ℃冰箱保存备用,按试剂说明书进行操作。

2.3.2 内皮微粒检测 大鼠麻醉后腹主动脉采血3 mL,置于抗凝管中,参考文献[5]测定,EMP<1.0 μm且CD31+/CD42-的微粒,采用流式细胞仪检测。

2.3.3 过氧化物酶体增殖活化受体γ辅助活化因子1α检测 大鼠麻醉取腹主动脉约4 cm长,PBS冲净,滤纸吸干放入冻存管,然后迅速投入液氮中,置-80 ℃冰箱保存备用。用Trizol提取总RNA,反转录成cDNA,PCR反应。PGC-1α引物由上海英骏生物技术服务有限公司合成。上游5'-TCAGTCCTCACTG GTGGACA-3',下游3'-TGCTTCGTCGTCAAAAACA G-3',产物长度126 bp。反应条件:94 ℃预变性4 min,94 ℃变性1 min,51 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,共35个循环;72 ℃再延伸5 min。1%琼脂凝胶电泳,然后用凝胶成像系统观察。

3 统计学方法

4 结果

4.1 丹蛭降糖胶囊联合不同强度运动干预对模型大鼠血清一氧化氮、内皮型一氧化氮合酶、血管性假血友病因子和内皮微粒水平的影响

与空白组比较,模型组NO、eNOS、vWF和EMP水平显著升高(P<0.05);与模型组比较,低强度组、高强度组、中药组NO、eNOS水平显著升高及vWF、EMP水平降低(P<0.05,P<0.01)。结果见表1。

表1 各组大鼠血清NO、eNOS、vWF和EMP水平比较(±s)

表1 各组大鼠血清NO、eNOS、vWF和EMP水平比较(±s)

注:与空白组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05,##P<0.01(下同)

组别 只数 NO/(μmol/L)eNOS/(ng/mL)vWF/(mU/mL)EMP/(个/μL)空白组 10 9.25±3.16 25.46±6.07 58.57±10.75 268.52±36.54模型组 8 4.56±1.93*9.87±3.49*90.53±18.14*781.62±60.23*低强度组 9 6.72±2.09#22.67±3.76#70.42±15.60#384.56±41.78#中强度组10 9.16±2.78##23.16±5.80##62.37±12.86##321.89±46.36##高强度组 9 8.09±3.11#20.75±11.05#66.81±14.01#452.62±66.12#中药组 9 7.23±2.92#20.63±10.88#63.75±13.91#402.56±51.21#

4.2 丹蛭降糖胶囊联合不同强度运动干预对模型大鼠过氧化物酶体增殖活化受体γ辅助活化因子1α表达的影响

与空白组比较,模型组PGC-1α表达水平明显下降(P<0.05);低强度组、中强度组、高强度组和中药组PGC-1α表达较模型组显著升高(P<0.05,P<0.01)。结果见图1。

图1 各组大鼠PGC-1α基因表达

5 讨论

糖尿病血管内皮损伤是多因素、多种病理机制所致,是影响患者预后的关键因素。NO是重要的调节血管张力的物质,具有舒张血管作用。高血糖可使血管内皮NO合成系统紊乱,损坏内皮细胞产生eNOS,使NO的生成减少,导致血管内皮功能的障碍。EMP是血管内皮在激活或凋亡时细胞膜脱落的小囊泡,其直径在0.1~l μm,携带着某些特异性抗原,糖尿病患者EMP水平明显升高。EMP的释放一方面负反馈于内皮系统,促进内皮损伤;另一方面,释放的EMP可降低eNOS的活性,减少NO生成,加速内皮损伤。EMP与血管病变的发生发展有着密切的相关性,是血管损伤、内皮细胞功能障碍的新兴生物标志物。这2个敏感性指标可直接反映血管内皮损伤的程度,有助于及时了解内皮功能动态变化。来自于血管内皮细胞的糖蛋白vWF,作为Ⅷ因子的载体,当血管内皮细胞受到损伤时,内皮细胞中vWF因子进入血液,促进血小板的聚集并黏附于受损的血管内皮细胞,在血栓形成过程中起关键作用。该指标可帮助判定糖尿病血管并发症发生的早晚及其严重程度。本实验结果显示,给予模型大鼠不同强度的运动并联合中药,可使血清eNOS、NO含量升高,血清vWF、EMP含量降低,并且这一结果与运动强度具有相关性。与单纯中药组及高强度组比较,中等强度运动更有助于改善血管内皮功能,说明适当运动有助于中药作用的充分发挥,与中药联合具有效果协同作用。

糖尿病的发生及血管内皮损伤与能量代谢有着密切的联系。线粒体是机体能量代谢的中心,参与多种生理过程,而线粒体的生成关系着线粒体的功能。在线粒体的生成过程中PGC-1α起着关键作用。PGC-1α可通过增加骨骼肌长链脂肪酸肌纤维膜线粒体膜的表达,促进线粒体脂肪酸氧化,提高胰岛素敏感性;另一方面可抑制脂肪酸诱导活性氧产生进而减少内皮细胞的凋亡,改善内皮状态。PGC-1α表达水平下降会显著降低线粒体呼吸率,降低生成ATP的能力。因此,PGC-1α水平的表达可直接反映能量代谢及内皮凋亡的变化。本研究结果表明,运动可增强中药对PGC-1α的表达调节,具有协同促进作用,而中等强度组疗效最为显著。

运动可增加机体能量消耗,使肌肉组织摄取葡萄糖增加。本研究结果进一步表明运动强度变化可调整胰岛素受体的表达,但运动强度并不是越大越好。中等强度的运动训练可使骨骼肌产生良好的适应性。这也与中医辨证思想“过犹不及”“中病即止”相一致。相对于高强度运动,中、低强度运动更能有效地控制血糖,改善糖尿病患者血管内皮功能,可作为防治糖尿病及血管并发症的有效手段。

[1] 于萍,李强,刘颖,等.2型糖尿病早期血管内皮功能变化的研究[J].中国实用内科杂志,2010,30(9):827-828.

[2] 程森华,方朝晖.氧化应激对糖尿病血管内皮的损伤机制及中医药干预研究[J].中医药临床杂志,2012,24(2):163-165.

[3] 方朝晖.丹蛭降糖胶囊联合运动对糖尿病大鼠胰腺NAPDH氧化酶亚单位p22phox表达水平的影响[J].中国中西医结合杂志,2013,33(5):641-645.

[4] BEDFORD T G, TIPTON C M, WILSON N C, et al. Maximum oxygen consumption of rats and its changes with various exper-imental procedures[J]. J Appl Physiol,1979,47(6):1278-1283.

[5] BERNAL-MIZRACHI L, JY W, JIMENEZ J, et al. High levels of eirculating endothelial microparticles in patients with acute coronary syndromes[J]. Am Heart J,2003,145(8):962-970.

Effects of Sports with Different Strength Combined with Traditional Chinese Medicine on

Function of Vascular Endothelium of IGT Rats

NI Ying-qun, FANG Zhao-hui (National Diabetic Base of

Clinical Research of Chinese Medical Science, First Affiliated Hospital of Anhui University of TCM, Hefei 230031, China)

Objective To observe the effects of sports with different strength combined with traditional Chinese medicine on expression of PGC-1α and function of vascular endothelium of IGT rats; To discuss the synergistic action and its mechanism. Methods Seventy healthy male SD rats were randomly divided into blank group (10 rats), which were given regular diet, and the other 60 rats were given high-glucose and high-lipoid diet to establish the IGT model rats, which were then randomly divided into 5 groups, including IGT model group (model group), simple Chinese medicine group (Chinese medicine group), low strength sports+Chinese medicine (low strength group), middle strength+Chinese medicine (middle strength group), and high strength sports+Chinese medicine groups (high strength group), 10 rats in each group. Rats in blank group, model group and Chinese medicine group exercised freely. While rats in different sport strength groups conducted treadmill exercise with different strength, and were given Danzhi Jiangtang Capsules for gavage. Changes of NO, eNOS, vWF and EMP before and after the treatment were compared, the PGC-1α level was detected. Results Compared with the blank group, levels of NO, eNOS and PGC-1α decreased, while the levels of vWF and EMP increased in model group (P<0.05). Compared with the model group, levels of NO, eNOS and PGC-1α increased in all treatment groups, while the levels of vWF and EMP decreased (P<0.05, P<0.01). Conclusion Middle strength sports combined with Danzhi Jiangtang Capsules may effectively improve function of vascular endothelium.

sports with different strength; glucose tolerance subsiding; PGC-1α; traditional Chinese medicine; rats

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.04.014

R285.5

A

1005-5304(2016)04-0054-04

2015-07-04)

2015-08-24;编辑:华强)

国家科技重大专项-重大新药创制(2010ZX09102);国家中医临床研究基地业务建设科研专项(JDZX201201);国家中医药管理局中医药重点学科(20091221);国家中医药管理局国家基本公共卫生服务项目(20131012);安徽省教育厅高校自然科学研究项目(KJ2015A136)

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