黔产铁皮石斛对阿司匹林诱导胃黏膜上皮细胞GES-1损伤的保护作用研究

杨传玉 胡珺 谭丹 陈思颖 杨畅 孙佳 刘亭 王爱民

(1. 贵州医科大学药学院，贵州 贵阳 550004；2.民族药与中药开发应用教育部工程研究中心，贵州 贵阳 550004；3.贵州省药物制剂重点实验室，贵州 贵阳 550004；)



黔产铁皮石斛对阿司匹林诱导胃黏膜上皮细胞GES-1损伤的保护作用研究

杨传玉1,2胡珺1,2谭丹1,2陈思颖1,3杨畅1,3孙佳1,3刘亭1,3王爱民1, 2△

(1. 贵州医科大学药学院，贵州 贵阳 550004；2.民族药与中药开发应用教育部工程研究中心，贵州 贵阳 550004；3.贵州省药物制剂重点实验室，贵州 贵阳 550004；)

目的 探讨铁皮石斛全提物对阿司匹林诱导人胃黏膜上皮细胞GES-1细胞损伤的药效作用。方法 体外培养人胃黏膜上皮细胞株GES-1细胞，经阿司匹林处理后，建立阿司匹林诱导GES-1细胞损伤模型；以阿司匹林联合铁皮石斛全提物各浓度预处理GES-1细胞为铁皮石斛组，以阿司匹林联合奥美拉唑预处理细胞为阳性组，并设立阴性对照组，采用MTS法检测细胞存活率,并通过比色法测定细胞上清液中LDH含量。结果 当阿司匹林的浓度为18.5 mmol/L处理GES-1细胞24 h时，细胞的抑制率为40%；铁皮石斛浓度范围0～500 μg/mL内，受损细胞存活率随铁皮石斛剂量增加而升高，LDH释放量逐渐降低(P<0.05)。结论 铁皮石斛对于阿司匹林诱导GES-1细胞损伤具有保护作用。

铁皮石斛； GES-1细胞; 阿司匹林; MTS方法; LDH含量测定

铁皮石斛为兰科石斛属植物铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)的干燥茎，又名黑节草，为我国传统名贵药材，有味甘、质重、黏性大等特点，享有“中华九大仙草之首”的美誉；《神农本草经》将其列为上品，有滋阴清热、益胃生津，润肺止咳等功效。铁皮石斛化学成分多样，主要含有生物碱、多糖、氨基酸、菲类等化合物，药理研究表明，铁皮石斛具有明显的抗氧化、抗肿瘤、降低血糖以及提高免疫力等作用，在治疗恶性肿瘤、糖尿病、白内障、关节炎等疾病方面具有较好的疗效[1]。历代中医认为，石斛性寒，味甘、淡、微咸，入胃、肾经，具有益胃生津、滋阴清热功效，石斛入胃经从而使胃津充足，受纳腐熟水谷、厚肠胃[2]，这提示铁皮石斛有一定保护胃损伤的作用。因此，本研究拟采用人胃黏膜上皮细胞株GES-1[3]分别与阿司匹林[4]、铁皮石斛体外共培养，通过MTS法检测细胞存活率和比色法检测细胞上清液乳酸脱氢酶(LDH)含量，共同探讨铁皮石斛对阿司匹林诱导胃黏膜上皮细胞GES-l损伤的保护作用。

1 材料和方法

1.1 材料 GES-1细胞：来源于人永生化胃黏膜上皮细胞(GES-1)，购于上海中科院细胞库。铁皮石斛药材：贵州罗甸铁皮石斛种植基地(贵州医科大学生药教研室龙庆德副教授鉴定)。主要试剂及仪器试剂材料：优质胎牛血清(澳洲Gibco)；胰蛋白酶(美国Hyclon)；磷酸盐缓冲液(美国HycAlon)；DMEM-H(澳洲Gibco)；LDH试剂盒(南京建成生物工程研究所)、MTS试剂盒(美国Promega)；二甲基亚砜(科秘欧化学试剂有限公司)；双抗(美国Hyclon)；阿司匹林(贵州圣都药业有限公司，A1507002)；CO2培养箱(美国Thermo)；酶标仪(上海伯乐生命医学产品有限公司)，倒置显微镜(日本尼康公司)。

1.2 铁皮石斛全提物的制备 铁皮石斛粉末300 g，加10倍量85%乙醇回流提取3次，2 h/次，纱布过滤，得滤液A；药渣挥干乙醇，加入30倍量水，95 ℃浸泡提取3次，2 h/次，纱布过滤，得滤液B，合并2次滤液，浓缩至浸膏，4 ℃密封保存。

1.3 方法

1.3.1 胃黏膜上皮细胞GES-1的培养 人胃黏膜细胞系GES-1细胞复苏后置于细胞培养瓶内，以DMEM高糖培养基 为培养液(含10%胎牛血清，1%双抗)，在37 ℃、5% CO2、相对湿度90%培养箱中培养，隔天更换培养液，每3 d按1∶3比例传代。

1.3.2 GES-1细胞损伤模型的建立 将GES-1细胞用含不同浓度阿司匹林的培养液作用24 h，造成GES-1细胞损伤，运用MTS法进行检测，结果最佳细胞模型为细胞抑制率为40%左右，以下实验均以此阿司匹林浓度为细胞损伤模型浓度[5-6]。

1.3.3 细胞的分组和处理 将细胞分为铁皮石斛不同浓度组，奥美拉唑阳性组、阿司匹林模型组、正常组。处理：取对数生长期的GES-1细胞按1×105个/mL接种于96孔培养板，常规放置37 ℃、5%CO2的培养箱培养24 h，吸取上清液，用PBS洗2次。模型组加入含40%抑制浓度阿司匹林的培养液100 μL，铁皮石斛组分别以不同浓度铁皮石斛全提物预处理6，12，24，36 h，再加入阿司匹林，使培养液中阿司匹林浓度为40%抑制浓度；奥美拉唑阳性组处理方法同铁皮石斛组，每组设5个复孔，同时设定不予药物干预的阴性对照组。MTS法检测细胞存活率 取各组细胞给予阿司匹林后培养24 h, 吸取上清液，用PBS洗2次，加入完全培养基，每孔加入MTS试剂5 μL，摇匀，继续放置37 ℃、5%CO2的培养箱培养培养3 h，以空白孔调零，于酶标仪490 nm波长处读取OD值。细胞存活率(%)=(OD样品/OD空白)×100%。LDH含量测定 取各测试孔上清液，按照试剂盒说明书检测各组细胞上清液中LDH含量。LDH (U/L)=(测定OD值-对照OD值) / (标准OD值-空白OD值) ×标准品浓度(0.2 mmol/L) ×1 000

2 结 果

2.1 细胞形态学观察 正常GES-1细胞在倒置显微镜下观察，其细胞生长旺盛、状态良好，细胞多数呈多边形或三角形，部分呈梭形，可见少量单个悬浮细胞，贴壁生长。阿司匹林损伤后，细胞皱缩，变圆，悬浮，部分细胞核固缩，部分细胞可见小空泡，随着阿司匹林浓度加大，死亡细胞逐渐增多。

2.2 阿司匹林诱导GES-1细胞损伤模型的建立 空白组细胞存活率(100±2.83)%，阿司匹林不同浓度作用GES-1细胞24 h后，12 mmol/L, 细胞存活率(82.18±4.40) %；16 mmol/L, 细胞存活率(78.50±3.91) %；18 mmol/L, 细胞存活率(76.50±5.99)%；18.5 mmol/L, 细胞存活率(61.88±3.21)%；20 mmol/L, 细胞存活率(38.18±2.13) %。各浓度均对细胞有损伤，随阿司匹林浓度增加，细胞的存活率降低，当其浓度为18.5 mmol/L时，其细胞抑制率达40%。2.3 不同浓度铁皮石斛对阿司匹林诱导GES-1细胞的影响 不同浓度铁皮石斛作用阿司匹林诱导的GES-1细胞损伤24 h后，与模型组比较，各铁皮石斛给药组的存活率明显增加，LDH释放量随铁皮石斛提取物浓度加大而降低，以临床常用的奥美拉唑作20 μg/mL为阳性对照，评价铁皮石斛不同浓度对于胃黏膜损伤的相关性，浓度为100 μg/mL的铁皮石斛与奥美拉唑药效相当。结果见表1～2。与模型组相比，铁皮石斛作用阿司匹林损伤的细胞6，12，36 h，其细胞存活率均有增加，LDH释放量减少，铁皮石斛对阿司匹林作用时间在24 h以内时，随时间延长，细胞存活率呈递增，LDH释放量逐渐减少；但超过24 h后，其作用效果与作用24 h差异不大。

表1 不同浓度铁皮石斛对阿司匹林损伤GES-1细胞存活率与LDH水平影响

注：与模型组比较，*P<0.05，△P<0.01。

表2 不同浓度铁皮石斛对阿司匹林损伤GES-1细胞LDH水平的影响

注：与模型组比较，*P<0.05,△P<0.01。

3 讨 论

传统中医认为铁皮石斛能够“厚肠胃”[2]，显示铁皮石斛对胃黏膜损伤有一定的保护作用，本实验以此为出发点，开展了一系列相关研究。随着阿司匹林临床应用的日趋广泛，其消化系统不良反应被受关注，其中胃黏膜损伤突出，主要表现出黏膜糜烂和溃疡，严重可发生出血或穿孔[7-8]。本实验选用人永生化胃黏膜上皮细胞GES-1细胞作为体外实验的细胞模型，在分子水平上更大程度地接近临床实验。实验采用不同浓度的阿司匹林诱导GES-1细胞损伤，结果发现，当阿司匹林浓为18.5 mmol/L时，细胞抑制率为40%，表明该浓度的阿司匹林是细胞损伤的最佳浓度，经多次实验发现，该方法条件稳定，操作较为简单，结果可靠。

在建立了稳定的细胞损伤模型后，给予不同浓度的铁皮石斛，通过MTS法检测受损细胞的存活率和比色法测定LDH释放量，当细胞损伤时，细胞膜的通透性增加，较多的LDH从细胞中漏出，其含量越高，表明细胞损伤越严重。初步证实了铁皮石斛对受损的胃黏膜上皮细胞有较好的保护作用，但仍需用体内模型进一步确认铁皮石斛是否对胃黏膜具有保护作用。

本实验观察了铁皮石斛不同作用时间对于受损细胞的保护作用，结果发现，在作用时间超过24 h后，细胞存活率与24 h变化无显著性差异，其原因可能是细胞生长受抑制导致该现象。因此，后期的实验研究将以此作用时间为参考，为本实验室下一步开展铁皮石斛保护胃黏膜受损活性部位筛选提供重要依据。

[1] 李玲, 邓晓兰, 赵兴兵, 等. 铁皮石斛化学成分及药理作用研究进展[J].肿瘤药学, 2011, 1(2):90-93.

[2] 印会河, 童瑶.中医基础理论[M].2 版.北京: 人民卫生出版社, 2007∶135.

[3] 温丽娜，罗昭逊，张姝，等.头花蓼对胃黏膜上皮细胞GES-1细胞毒性的研究[J].贵州医药，2014,38(10):878-880.

[4] 张弓羽,张振玉. 阿司匹林对人胃黏膜上皮细胞生长和occludin蛋白表达的影响及其机制研究[J]. 胃肠病学,2013,16(7)：400-403.

[5] Du J, Li XH, Zhang W,et al. Involvement of glutamate-cystine/glutamate transporter system in aspirin-induced acute gastric mucosa injure [J]. Biochemicaland Biophysical Research Communications,2014, 5(69): 135-141.

[6] Xue TM, Dong HX, Si KX,et al.Novel role of Zn (Ⅱ)-curcumin in enhancing cell proliferation and adjusting proinflammatory cytokine-mediated oxidative damage of ethanol-induced acute gastric ulcers [J]. Chemico-Biological Interactions,2012, 3(6):31-39.

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Study on the protect effect of Dendrobium officinale Kimura et Migo from Guizhou on human gastric epithelial cell injury induced by aspirin

YangChuanyu1,2,HuJun1,2,TanDan1,2,ChenSiying1,3,YangChang1,3,SunJia1,3,LiuTing1,3,WangAimin1,2.

1.SchoolofPharmacy,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China.2.EngineeringResearchCenterfortheDevelopmentandApplicationofEthnicMedicineandTCMofEducationMinistry,Guiyang550004,China. 3.GuizhouProvincialKeyLaboratoryofPharmaceutics,Guiyang550004,China.

Objective To investigate the protective effects of Dendrobium officinale Kimura et Migo extracts on aspirin-induced injury in human gastric mucosal epithelium cells (GES-1). Methods Human gastric epithelial cell line GES-1 was cultured in vitro. In aspirin group, GES-1 cells were treated with aspirin. GES-1 cells in Dendrobium officinale Kimura et Migo group were pretreated with different concentrations of Dendrobium officinale Kimura et Migo extracts before aspirin treatment. In omeprazole group, GES-1 cells were pretreated with omeprazole before aspirin treatment. And a negative control group was established simultaneously. MTS assay was used to detect the cell viability. The content of LDH was also determined by the LDH kit. Results Incubated at 18.5 mmol/L of aspirin for 24 h, GES-1 cell inhibitory rate reached 40% as the injury model of GES-1 cells, 0～500 μg/mL concentrations of Dendrobium officinale Kimura et Migo had a protective effect on the GES-1 cells to some extent, respectively. Moreover, these protective effects were more obvious with the increase of concentrations of Dendrobium officinale Kimura et Migo extracts. And the content of LDH was also released. Conclusion Dendrobium officinale Kimura et Migo extracts can promote proliferation to injury human gastric epithelial cell line GES-1 induced by aspirin.

Dendrobium officinale Kimura et Migo； GES-1 cells； Aspirin； MTS assay； LDH

贵州省中药现代化科技产业研究开发专项项目[黔科合SY字(2014)3032-2号]；民族药与中药开发应用产学研基地建设[黔科合KY字(2013)122]；民族药化学成分及活性研究[黔科合人字(2015)11号)

R285.5

A

1000-744X(2016)09-0905-03

2016-05-16)

△通信作者，E-mail：gywam100@163.com