胶原诱导性关节炎大鼠在中药作用下对其关节炎指数、IL-1β、TNF-α、PGE2、RANKL及OPG的影响探讨

杨帆 杨勇 廉婧 彭页 刘巍

(1. 火箭军总医院礼士路门诊部，北京 100820；2. 火箭军总医院骨科，北京 100088；3. 解放军总医院南楼临床部消化内科，北京 100853；4.中国人民解放军空军总医院骨科，北京 100142；5.中国人民解放军第四一三医院麻醉科，浙江 舟山 316004)



胶原诱导性关节炎大鼠在中药作用下对其关节炎指数、IL-1β、TNF-α、PGE2、RANKL及OPG的影响探讨

杨帆1杨勇2廉婧3彭页4刘巍5△

(1. 火箭军总医院礼士路门诊部，北京 100820；2. 火箭军总医院骨科，北京 100088；3. 解放军总医院南楼临床部消化内科，北京 100853；4.中国人民解放军空军总医院骨科，北京 100142；5.中国人民解放军第四一三医院麻醉科，浙江 舟山 316004)

目的 探讨胶原诱导性关节炎大鼠在中药作用下对其关节炎指数、白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、前列腺素E2(PGE2)、核因子-kB受体活化因子配体(RANKL)及护骨素(OPG)的影响。方法 取Wistar大鼠48只随机分为空白组、模型组、阳性组、A、B、C组。复制胶原诱导性关节炎大鼠模型，连续干预 4周后，各组大鼠眼眶静脉取血，观察关节炎指数、IL-1β、TNF-α、PGE2、RANKL及OPG。结果 与空白组相比，其余各组大鼠关节炎指数均明显增加(P<0.05)。与模型组相比，阳性组、A、B、C组关节炎指数均明显降低(P<0.05)。与空白组相比，模型组血清IL-1β、TNF-α、PGE2、RANKL、OPG及RANKL/OPG水平均明显升高(P<0.05)。与模型组相比，阳性组、A、B、C组血清IL-1β、TNF-α、PGE2、RANKL、OPG及RANKL/OPG水平明显降低(P<0.05)，且A、B、C组大鼠血清IL-1β、TNF-α、PGE2水平抑制作用及对RANKL、OPG及RANKL/OPG的改善情况均优于阳性组(P<0.05)。组织病理学结果显示，A、B、C组可抑制 CIA 大鼠关节组织病理学改变。结论 自拟除痹汤可明显降低CIA模型大鼠的关节炎指数及关节组织病理学改变，下调IL-1β、TNF-α、PGE2水平，抑制RANKL、OPG，从而可以有效防治CIA。

胶原诱导性关节炎； 白细胞介素1β； 肿瘤坏死因子α； 前列腺素E2； 核因子-κB受体活化因子配体； 护骨素

类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一种自身免疫性疾病，反复发作，其发病主要靶组织是作用于关节滑膜[1]。RA多发于30岁后患者，女性发病高于男性。对于RA的治疗，西医主要以非甾体类抗炎药、基因免疫及外科手术治疗作为基本治疗方法，虽然上述方法在短期内能够缓解症状、在一定程度上能够阻止骨关节病变的继续进展 ，然而长期应用后，往往加重机体自身免疫失调[2]。中医药在治疗RA过程中有自己独特的优势，且不良反应较少，成为目前广大专家关注的热点内容[3]。然而，中医药作为规范的诊疗方案指导临床，目前尚缺乏理论基础和实验数据的支持。基于此，笔者采用Ⅱ型胶原蛋白诱导法造模胶原诱导性(CIA)大鼠模型，给予自拟除痹汤进行治疗，观察其对CIA大鼠关节变化的影响，以期为临床治疗RA提供理论及实验依据。

1 材料和方法

1.1 药品、试剂及仪器 自拟除痹汤(方药组成：骆驼篷草、鹿含草、当归、补骨脂、桑寄生、黄芪、续断、白术、炒麦芽、细辛，均购自张仲景大药房)，上述诸药加水煎煮、抽滤、蒸发浓缩成水煎剂(相当于生药1.90 g/mL)。雷公藤多苷片：由浙江普洛康裕天然药物有限公司生产，批准文号：国药准字Z33020778。弗氏完全佐剂(FAC)、Ⅱ型胶原蛋白由上海钰博生物科技有限公司提供。冰醋酸：由张家港保税区明乐化工有限公司提供。TNF-α试剂盒由上海基免实业有限公司提供。IL-1β试剂盒由北京索莱宝科技有限公司提供。PGE2试剂盒由上海研谨生物科技有限公司提供。RANKL试剂盒由上海丰寿实业有限公司提供。OPG试剂盒由上海乔羽生物科技有限公司提供。

1.2 实验动物 Wistar大鼠, 雄性，体质量180～200 g，由山东鲁抗医药有限公司提供，生产许可证号：SCXK(鲁)20130001。

1.3 方法 取大鼠48只，采用随机数字分组法将其分为空白组、模型组、阳性组、自拟除痹汤大计量组(A组)、自拟除痹汤中计量组(B组)、自拟除痹汤小计量组(C组)，每组8只。除空白组外，将Ⅱ型胶原蛋白用弗氏完全佐剂(FAC)配成3.0 mg/mL的乳剂，在大鼠左后足跖皮内注射,110 μL/只，复制CIA大鼠模型。其中，空白组大鼠左后足跖皮内注射同体积的生理盐水。连续造模10 d。空白组、模型组大鼠给予同容积生理盐水，A组、B组、C组给予自拟除痹汤(生药38.0 g/kg，19.0 g/kg，9.5 g/kg)，阳性组给予雷公藤多苷片混悬液5.0 g/kg，连续给药4周。所有大鼠每周称重1次。

1.4 指标测定 (1)采用0～4级评分法对关节炎指数进行评分，满分为18分：①0分，趾关节未见红肿；②1分，趾关节出现红肿；③2分，趾关节及足趾均出现肿胀；④3分，趾关节以下足爪出现肿胀；⑤4分，全部足爪均出现肿胀且严重变形。(2)TNF-α、IL-1β、PGE2水平测定：采用ELISA法对大鼠血清TNF-α、IL-1β、PGE2水平进行测定。(3)RANKL及OPG表达测定：采用ELISA法对RANKL及OPG进行测定。(4)病理学检查：处死大鼠，取关节滑膜组织，用10%甲醛固定，石蜡包埋，切片，HE染色，镜下观察各组大鼠病理组织变化。

2 结 果

2.1 不同组别大鼠的关节炎指数对比 与空白组相比，其余各组大鼠关节炎指数均明显增加，且差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比，阳性组、A、B、C组关节炎指数均明显降低，且差异有统计学意义(P<0.05)。结果见表1。

表1 不同组别大鼠的关节炎指数对比

注：与空白组相比，*P<0.05；与模型组相比，▲P<0.05。

2.2 不同组别大鼠TNF-α、IL-1β、PGE2水平影响对比 与空白组相比，模型组血清IL-1β、TNF-α、PGE2水平均明显升高(P<0.05)。与模型组相比，阳性组、A、B、C组血清IL-1β、TNF-α、PGE2水平明显降低(P<0.05)，且A、B、C组大鼠血清IL-1β、TNF-α、PGE2水平抑制作用优于阳性组(P<0.05)。结果见表2。

表2 不同组别大鼠对TNF-α、IL-1β、PGE2水平影响对比

注：与空白组相比，*P<0.05；与模型组相比，▲P<0.05。

2.3 不同组别大鼠RANKL及OPG表达的对比 与空白组相比，模型组血清RANKL、OPG及RANKL/OPG均明显升高(P<0.05)。与模型组相比，阳性组、A、B、C组血清RANKL、OPG及RANKL/OPG均显著降低(P<0.05)，且A、B、C组大鼠血清RANKL、OPG及RANKL/OPG的改善情况均优于阳性组(P<0.05)。结果见表3。

表3 不同组别大鼠RANKL及OPG表达的对比

注：与空白组相比，*P<0.05；与模型组相比，▲P<0.05。

2.4 不同组别大鼠关节滑膜组织病理组织结果对比 病理学结果显示，空白组关节腔滑膜结构清晰，细胞排列整齐，滑膜内未见炎性细胞浸润，关节软骨及滑膜下细小血管均未见异常。模型组关节腔滑膜细胞增生明显、呈散乱性排列、且大小不一、间隙狭窄，部分细胞已纤维化，浆细胞、淋巴细胞、单核细胞等大量炎性细胞充斥于滑膜内，滑膜组织广泛水肿，可见多发的细小血管，严重部分己形成管黯，关节软骨表面剥脱，侵蚀严重。阳性组病变程度与自拟除痹汤各组基本相同，表现为：关节腔滑膜增生不明显，仅有部分镜下存在细胞间隙和排列不齐，可见部分组织水肿，并可见少量炎性细胞，其中，A组滑膜下可见散片的毛细血管，但较模型组明显减少，未见血管黯，关节软骨仍有表面侵蚀，较模型组略有减轻。结果见图1。

3 讨 论

RA是临床常见的慢性自身免疫性疾病，对于RA的发病机制较为复杂，至今尚无定论[4]。研究[5]发现，细胞因子在RA的发病过程占据重要地位，尤其是IL-1β、TNF-α在RA的发病中扮演举足轻重的地位。TNF-α是产生于滑膜及软骨血管翳的巨噬细胞，属于炎症分子，能够向上调节滑膜细胞中的细胞因子、PGE2等。研究[8]认为，在类风湿性关节炎发生时， IL-1基因在CD14+巨噬细胞中具有优势表达。IL-1对于滑膜细胞及浸润的淋巴细胞具有增殖和分化作用，有助于促进花生四烯酸的生成，可导致PGE2及胶原酶的合成与释放[6]。研究[9]发现，RANKL可介导破骨细胞的增殖活化，这在RA骨质破坏进程中起着重要的作用。OPG是肿瘤坏死因子受体超家族中一员[7]，是一种可溶性蛋白质，是RANKL的天然阻断受体，能够阻断与RANK的结合，抑制破骨细胞的增殖活化。

研究[8]发现，一些中药能够有效抑制炎症因子，阻止破骨细胞增殖活化，使RANKL降低、护骨素升高、调节RANKL/OPG比值[9]，发挥其抑制关节破坏及骨吸收的作用。本研究所用自拟除痹汤具有补益肝肾、滋养气血、散寒祛瘀通络之功效。方中骆驼蓬草能够坚固筋骨、散寒除湿；配伍鹿含草以养肝补肾、强筋壮骨、祛风、除湿、止血；合用当归以补血活血、调经止痛、润肠通便；配伍补骨脂以温肾助阳、止泻；桑寄生具有除风湿、通经络、益血、安胎之功效，黄芪具有补气固表、利水退肿、祛毒排脓、生肌之功效；续断具有补益肝肾、强筋健骨、止血安胎、疗伤续折之功效；白术具有健脾益气、燥湿利水、止汗、安胎之功效；炒麦芽具有行气消食、健脾开胃、退乳消胀之功效；细辛具有祛风散寒、通窍止痛、温肺化饮之功效[9]。本方配伍合理，诸药相合共奏补益肝肾、滋养气血、散寒、祛瘀、通络之功效。现代药理研究[10-11]表明，当归、黄芪能够抑制IL-1β、IL-2及TNF-α，发挥抗炎、镇痛的作用；补骨脂抑制过高的免疫球蛋白IgA、IgG及IgM恢复正常。

本组研究结果显示，与空白组相比，其余各组大鼠关节炎指数均明显增加。与模型组相比，阳性组、A、B、C组关节炎指数均明显降低。与空白组相比，模型组血清IL-1β、TNF-α、PGE2水平均明显升高。与模型组相比，阳性组、自拟除痹汤大、中、小剂量组血清IL-1β、TNF-α、PGE2水平明显降低，且A、B、C组大鼠血清IL-1β、TNF-α、PGE2水平抑制作用优于阳性组。与空白组相比，模型组血清RANKL、OPG及RANKL/OPG均明显升高。与模型组相比，阳性组、A、B、C组血清RANKL、OPG及RANKL/OPG均显著降低，且A、B、C组大鼠血清RANKL、OPG及RANKL/OPG的改善情况均优于阳性组。组织病理学结果显示，A、B、C组下可抑制 CIA 大鼠关节组织病理学改变。上述结果提示，自拟除痹汤能够明显改善CIA模型大鼠引起的类风湿性关节炎。

综上所述，自拟除痹汤可明显降低CIA模型大鼠的关节炎指数及关节组织病理学改变，下调IL-1β、TNF-α、PGE2，抑制RANKL、OPG，从而达到有效防治CIA的目的。

(本文图1见封三)

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Effect of arthritis index, IL-1β, TNF-α and PGE2level, RANKL and osteoprotegerin by collagen induced arthritis in rats under the action of traditional Chinese Medicine

YangFan1,YangYong2,LianJing3,PengYe4,LiuWei5.

1.DepartmentofClinicinLishiRoad,GeneralHospitalofRocketArmy,Beijing100820,China. 2.DepartmentofOrthopedics,GeneralHospitalofRocketArmy,Beijing100088,China. 3.DepartmentofDigestionMedicineofClinic,GeneralHospitalofChinesePeopleLiberationArmy,Beijing100853,China. 4.DepartmentofOrthopedics,AirForceGeneralHospitalofChinesePLA,Beijing100142,China. 5.DepartmentofAnesthesiology,the413HospitalofChinesePLA,Zhoushan316004,China.

Objective To discuss the effect of arthritis index, IL-1β, TNF-α and PGE2level, RANKL and OPG by collagen induced arthritis in rats under the action of traditional Chinese Medicine. Methods According to the random number table, 48 wistar rats were divided into the normal control group, model group, positive control group, group A, B, C. All rats were copied the model of collagen induced arthritis, after 4 weeks of continuous intervention, each rat were orbital venous blood, and then were observed arthritis index,IL-1β,TNF-α and PGE2, RANKL and OPG. Results Compared with the control group, arthritis index of rats in other groups were significantly increased (P<0.05). Compared with the model group, the arthritis index of the positive group and group A，B，C were decreased significantly (P<0.05). Compared with the blank group, the levels of IL-1β，TNF-α，PGE2，RANKL,OPG and RANKL/OPG of serum of the model group rats were significantly increased (P<0.05).The levels of IL-1β，TNF-α，PGE2，RANKL, OPG and RANKL/OPG of serum in the positive group, group A, B, C were significantly decreased than that of the model group (P<0.05), and the inhibition of the levels of IL-1β, TNF-α, PGE2and the improvement of the RANKL,OPG and RANKL/OPG of serum in the group A, B, C were better than the positive group (P<0.05). Histopathological results showed that the group A, B, C could inhibit the pathological changes of articular tissue in CIA rats. Conclusion The ZI NI CHU BI TANG can significantly reduce arthritis index and the histological change of articular tissue pathology, reduce the level of the IL-1β, TNF-α, PGE2, inhibit the RANKL, OPG, and then can effectively prevent CIA.

Collagen-Induced Arthritis； IL-1β； TNF-α； PGE2； RANKL； Osteoprotegerin

国家自然科学基金(项目编号81403451)

R285.5

A

1000-744X(2016)09-0902-03

2016-04-13)

△通信作者，E-mail:1039331979@qq.com