丹蒌片和血府逐瘀颗粒对动脉粥样硬化大鼠脂质代谢和炎症反应影响的比较研究

陈洁　缪静　徐晓明　戴金　毛威

丹蒌片和血府逐瘀颗粒对动脉粥样硬化大鼠脂质代谢和炎症反应影响的比较研究

陈洁缪静徐晓明戴金毛威

目的观察丹蒌片和血府逐瘀颗粒对动脉粥样硬化大鼠脂质代谢和炎症反应的影响。方法40只雄性Wistar大鼠随机分为正常组、模型组、阿托伐他汀钙组、丹蒌片组、血府逐瘀颗粒组，每组8只。正常组大鼠喂食基础饲料，余4组均采用高脂饮食联合维生素D3腹腔注射的方法复制大鼠动脉粥样硬化模型。模型组、阿托伐他汀钙组、丹蒌片组、血府逐瘀颗粒组分别给予生理盐水、阿托伐他汀钙混悬液、丹蒌片混悬液、血府逐瘀颗粒混悬液灌胃干预8周。干预结束后，检测大鼠血清中总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）、脂蛋白相关磷脂酶A2（LP-PLA2）水平，采用荧光定量PCR法检测大鼠胸主动脉内IL-6、TNF-α、MCP-1、LP-PLA2 mRNA表达。结果与正常组比较，模型组大鼠血清中TC、TG、LDL-C和IL-6、TNF-α、MCP-1、ox-LDL、LP-PLA2水平升高（均P＜0.05），胸主动脉内炎症因子IL-6、TNF-α、MCP-1和LP-PLA2 mRNA表达上调（均P＜0.05）。与模型组比较，阿托伐他汀钙组与丹蒌片组均能降低动脉粥样硬化模型大鼠血清中TC、TG、LDL-C和IL-6、TNF-α、MCP-1、ox-LDL、LP-PLA2水平（均P＜0.05），胸主动脉内IL-6、TNF-α、MCP-1和LP-PLA2 mRNA表达下调（P＜0.05），组间比较差异无统计学意义（均P＞0.05）。血府逐瘀颗粒组能降低血清中TC和炎症因子IL-6、TNF-α、MCP-1，抑制胸主动脉内IL-6、TNF-α、MCP-1 mRNA表达（均P＜0.05），而血清中的TG、LDL-C、ox-LDL、LP-PLA2水平和胸主动脉内LP-PLA2 mRNA表达与模型组相比差异无统计学意义（均P＞0.05）。结论丹蒌片和血府逐瘀颗粒均能抑制动脉粥样硬化大鼠炎症因子的表达，丹蒌片调节脂质代谢的作用优于血府逐瘀颗粒。

动脉粥样硬化；炎症反应；脂质代谢；丹蒌片；血府逐瘀颗粒

冠心病是当今最主要的致死性疾病之一，在祖国医学中属“胸痹”、“心痛”范畴，病因病机复杂，治法繁多[1]。其中活血化瘀法和痰瘀同治法是目前应用最广，研究最多的治法，活血化瘀法主要以“活血祛瘀，通脉止痛”为主，血府逐瘀汤是临床上较常用的活血化瘀方剂；而痰瘀同治法主张“化痰祛瘀、化痰为先”，丹蒌片是根据痰瘀同治方剂所制的代表药物。目前公认，冠心病的病理基础是动脉粥样硬化，脂质代谢和炎症反应与动脉粥样硬化关系密切，因此，我们以血府逐瘀颗粒和丹蒌片为观察药物，从脂质代谢和炎症反应角度探讨和比较活血化瘀和痰瘀同治不同中医治法对动脉粥样硬化的影响，现报道如下。

1　实验材料和方法

1.1实验动物SPF级健康雄性Wistar大鼠40只，体重（160±10）g，由中国科学院上海实验动物中心/上海斯莱克实验动物有限责任公司提供[SCXK（沪）2012-0002]，饲养于浙江中医药大学动物实验研究中心屏障系统大鼠饲养室[SYXK（浙）2013-0184]，实验期间按实验动物使用的“3R”原则给以人道主义关怀。

1.2药物和试剂阿托伐他汀钙（商品名：立普妥，20mg×7片，国药准字H20051408）由美国辉瑞制药有限公司提供；丹蒌片由吉林康乃尔药业有限公司惠赠成品药粉；血府逐瘀颗粒由内蒙古康恩贝药业有限公司提供；维生素D3注射液购自上海通用药业股份有限公司。血清生化指标检测试剂：总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）均购自上海申能德赛诊断技术有限公司；ELISA检测试剂盒：白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）、脂蛋白相关磷脂酶A2（LP-PLA2）均购自上海西唐生物科技有限公司；总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、荧光定量试剂盒均购自日本TaKaRa公司。

1.3主要仪器和设备7020型全自动生化分析仪购自日本日立公司；Thermo多功能酶标仪购自美国Thermo公司；PTC-200型PCR仪、iQ5型RT-PCR仪购自美国BIO-Rad公司。

1.4方法

1.4.1实验分组和建模雄性Wistar大鼠40只，适应性喂养1周后，按随机数字表法分为正常组、模型组、阿托伐他汀钙组、丹蒌片组、血府逐瘀颗粒组，每组8只。正常组喂食基础饲料，其余4组参照文献[2]采用高脂饮食+维生素D3腹腔注射方法复制大鼠动脉粥样硬化模型，高脂饲喂（1.25％胆固醇、0.5％3号胆盐、10％蛋黄粉，10％蔗糖、10％猪油、68.25％基础饲料），同时在喂食开始时一次性腹腔注射维生素D340万U/kg，之后隔日腹腔注射10万U/kg×3次。

1.4.2给药方法造模4周后，根据人和动物体表面积折算的等效剂量比率表计算，以临床等效剂量给药，实施灌胃干预措施8周。正常组和模型组分别给予0.9％氯化钠溶液10ml/（kg·d）灌胃，阿托伐他汀钙组给予阿托伐他汀钙0.18mg/ml，10ml/ （kg·d）灌胃，丹蒌片组给予丹蒌片45mg/ml，10ml/ （kg·d）灌胃，血府逐瘀颗粒组给予血府逐瘀颗粒100mg/ml，10ml/（kg·d）灌胃。

1.4.3相关指标检测灌胃8周后，5组大鼠禁食不禁水12h，4％水和氯醛1ml/100g腹腔注射麻醉，直接心脏取血，取血完毕后，立即游离整段胸主动脉，横向切取胸主动脉并放入液氮冷冻罐中冻存，备组织RNA提取使用。（1）血清生化指标及IL-6、TNF-α、MCP-1、ox-LDL和LP-PLA2检测：用全自动生化仪测定大鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C等指标。采用ELISA法分别测定血清中IL-6、TNF-α、MCP-1、ox-LDL和LP-PLA2含量。操作步骤按照试剂盒说明进行。（2）胸主动脉内IL-6、TNF-α、MCP-1和LP-PLA2 mRNA测定：用总RNA提取试剂盒提取大鼠胸主动脉总RNA，用紫外分光光度仪测定其吸光度（A260）值总RNA的浓度，并用逆转录试剂盒合成cDNA，操作步骤按日本TaKaRa公司产品操作说明书进行。将cDNA用实时荧光定量PCR仪进行扩增，PCR扩增条件为：95℃变性5min；（95℃×10s，60℃×30s，72℃×30s）×40个循环后；72℃延伸7 min。以GAPDH为内参基因，用Primer 5.0软件设计引物，大鼠IL-6、TNF-α、MCP-1、LP-PLA2和GAPDH mRNA序列的引物见表1。所有信息由Bio-Rad iQ5 PCR仪收集，根据Ct值，通过2-△△Ct法计算各个基因的相对表达量。

表1　实时荧光定量PCR引物序列

1.5统计学处理应用SPSS19.0统计软件，进行正态分布检验和方差齐性检验后，计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。

2　结果

2.1各组大鼠血清生化指标比较见表2。

表2　各组大鼠血清生化指标比较（mmol/L）

由表2可见，模型组大鼠血清TC、TG、LDL-C水平较正常组升高，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。阿托伐他汀钙组、丹蒌片组大鼠血清TC、TG、LDL-C水平均较模型组降低（均P＜0.05），但前两组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。而血府逐瘀颗粒组大鼠血清仅TC降低，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05），LDL-C和TG水平与模型组比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。模型组大鼠血清HDL-C水平虽较正常组降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）。3个药物组大鼠的血清HDL-C水平虽有升高趋势，但与模型组比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

2.2各组大鼠血清IL-6、TNF-α、MCP-1、ox-LDL 和LP-PLA2水平比较见表3。

由表3可见，与正常组比较，模型组大鼠血清IL-6、TNF-α、MCP-1、ox-LDL、LP-PLA2水平升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。阿托伐他汀钙组、丹蒌片组大鼠血清IL-6、TNF-α、MCP-1、ox-LDL、LP-PLA2水平均较模型组降低（均P＜0.05），但前两组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。血府逐瘀颗粒组大鼠血清仅IL-6、MCP-1降低，与模型组比较差异均有统计学意义（均P＜0.05），ox-LDL、LP-PLA2水平与模型组比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

2.3大鼠胸主动脉内IL-6、TNF-α、MCP-1和LP-PLA2 mRNA水平见表4。

由表4可见，与正常组比较，模型组大鼠胸主动脉内IL-6、TNF-α、MCP-1、LP-PLA2 mRNA表达升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05），阿托伐他汀钙组、丹蒌片组、血府逐瘀颗粒组胸主动脉内IL-6、TNF-α、MCP-1 mRNA表达均较模型组降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。阿托伐他汀钙组、丹蒌片组大鼠胸主动脉LP-PLA2 mRNA表达下调，与模型组比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）。但是，血府逐瘀颗粒组大鼠LP-PLA2 mRNA表达下调不明显，与模型组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3　各组大鼠血清IL-6、TNF-α、MCP-1、ox-LDL和LP-PLA2水平比较

表4　各组大鼠胸主动脉IL-6、TNF-α、MCP-1和LP-PLA2 mRNA水平比较

3　讨论

动脉粥样硬化病因病机复杂，治法繁多，在其复杂的病机和治法领域，血瘀证和活血化瘀疗法一直是中医药防治动脉粥样硬化研究中应用最早、使用最多、研究最深入的领域，在20世纪七、八十年代占主导地位。血瘀证的研究主要集中在炎症、血流动力学、血小板功能、微循环等方面，研究证明，血瘀证与血液循环和微循环障碍、血液高黏滞状态、血小板活化和黏附聚集、血栓形成、炎症反应等多种病理生理改变有关[3-4]。活血化瘀类中药具有抑制血小板聚集、抗凝、抗血栓形成、抑制炎症反应、改善微循环等生理功能[5-6]。

但是，血瘀证的理论并不能解释动脉粥样硬化的病因和早期识别动脉粥样硬化的危险因素，单纯的活血化瘀法已不能满足现代早防早治动脉粥样硬化的要求。痰瘀理论的提出弥补了血瘀证的不足。现代医学认为，动脉粥样硬化的病因和危险因素众多，有高血脂、高血压、高血糖、高龄、缺乏运动、吸烟等，但最重要的是高脂血症和脂质代谢异常，既是动脉粥样硬化重要的促发因素，又是动脉粥样硬化发展的推动因素。在长期高脂血症情况下，增高的脂蛋白对动脉内膜产生损伤，内皮受损后，促发多种炎症因子和黏附分子产生，促进单核细胞黏附内皮细胞，并移行进入血管壁，分化为巨噬细胞，后者吞噬大量脂质转变为泡沫细胞,堆积在动脉粥样硬化病灶处，促使粥样硬化斑块的形成和不稳定化。痰瘀理论认为，“痰浊”、“血瘀”是动脉粥样硬化的重要病因[7]，“痰浊”是指长期饮食不节或肥胖少动，损伤脾胃，脾胃虚衰导致津液代谢失常，停聚体内，内生为痰浊。这种病理产物一旦形成，流窜停滞于机体各个组织器官中，引起血液黏稠性增高，流动性降低，从而产生瘀血，最终导致疾病发生[8]。痰瘀理论很好地揭示了动脉粥样硬化的病因，与现代医学认为高脂高糖、缺少运动、肥胖等危险因素具有高度的一致性。随着人们生活水平的提高，不健康饮食和不良的生活习惯，必然导致痰瘀型患者的增加。

血府逐瘀颗粒是根据活血化瘀经典方——血府逐瘀汤制成，丹蒌片是痰瘀同治的经典方。临床研究证实，血府逐瘀汤能明显改善冠心病心绞痛患者的临床症状，降低血浆超敏C反应蛋白，改善血液流变学[9-10]。丹蒌片能减少冠心病患者心绞痛发作频率、疼痛持续时间、硝酸甘油用量等，降低炎症因子及抗氧化作用[11]。实验中，我们分别用血府逐瘀颗粒和丹蒌片干预高脂喂养的动脉粥样硬化大鼠，结果发现两组对IL-6、TNF-α、MCP-1等炎症因子的表达均有很好的抑制作用，无论是血清中因子水平还是胸主动脉中的基因表达均下降，与模型组相比差异有统计学意义，而与阿托伐他汀钙组相比，差异无统计学意义。说明活血化瘀和痰瘀同治两种中医治疗方案均有很好的抑炎功效。

ox-LDL是LDL-C氧化后的产物，通过受体发挥促炎、促泡沫细胞形成、促发动脉粥样硬化的作用，比天然的LDL-C起着更重要的地位[12]。LP-PLA2是最近发现的一种炎性标记物，是连接动脉粥样硬化脂质代谢和炎症反应的关键酶[13-14]，其主要作用是水解ox-LDL上的氧化磷脂，生成溶血卵磷脂和氧化游离脂肪酸[15]，后两者为促炎介质，能刺激黏附分子和炎性细胞因子的产生。ox-LDL可以上调LP-PLA2的表达[16]，LP-PLA2反过来又增强ox-LDL的促炎、促动脉粥样硬化的作用。动脉粥样硬化患者往往同时伴有ox-LDL、LP-PLA2升高，LP-PLA2已成为防治动脉粥样硬化的一个重要靶点。本研究发现，血府逐瘀颗粒组大鼠血清中除TC与模型组比较差异有统计学意义外，LDL-C、TG、ox-LDL、LP-PLA2下降均不明显，与模型组相比差异无统计学意义，胸主动脉组织内LP-PLA2表达也没有明显下降。但是，丹蒌片组大鼠血清中TC、LDL-C、TG、ox-LDL、LP-PLA2水平均明显下降，胸主动脉LP-PLA2表达下调，与模型组比较差异有统计学意义，说明丹蒌片能降低LDL-C、减少LDL-C氧化和ox-LDL生成，抑制LP-PLA2靶点的表达，而血府逐瘀颗粒对血脂的调节和LP-PLA2靶点的抑制作用不明显。丹蒌片调节脂质代谢的作用优于血府逐瘀颗粒。

综上所述，血府逐瘀颗粒（活血化瘀法）有很好的抑炎、抗血小板聚集、抗血栓作用，决定了其治疗侧重于斑块破裂后，治疗急性心血管事件为主，丹蒌片（痰瘀同治法）即治痰又治瘀，其良好的血脂调节作用决定其更适用于斑块破裂前，稳定斑块，减少破裂，可早期预防和治疗动脉粥样硬化。根据疾病不同的时期，采用不同的中医疗法，辩证施治方为上策。

[1]杨秋梅.浅谈中医防治冠心病的治疗方案[J].健康必读杂志,2013, 3（3）∶347-348.

[2]刘艳,王坤根,叶武,等.痰瘀共治对大鼠动脉粥样硬化斑块的影响及其可能机制[J].中华中医药学刊,2008,26（7）∶1466-1469.

[3]陈可冀,李连达,翁维良,等.血瘀证与活血化瘀研究[J].中西医结合心脑血管病杂志,2005,3（1）∶1-2.

[4]马晓娟,殷惠军,陈可冀.血瘀证与炎症相关性的研究进展[J].中国中西医结合杂志,2007,27（7）∶669-672.

[5]刘群峰,蔡光先.血府逐瘀汤治疗冠心病心血瘀阻证研究进展[J].光明中医,2012,27（10）∶2130-2132.

[6]杜朝阳,何佳,胡业彬.活血化瘀中药干预动脉粥样硬化作用机制研究进展[J].实用中医药杂志,2014,30（11）∶1067.

[7]赵步长,伍海勤,王一民,等.动脉粥样硬化中医浅析[J].光明中医, 2012,27（12）∶2518-2522.

[8]支艳,马建伟,魏汉林,等.试论中医痰瘀相关理论[J].中医临床研究, 2011,3（2）∶58-60.

[9]蔡兴芬,陈龙胜,吴春美.血府逐瘀汤联合西药治疗冠心病心绞痛的疗效观察及其对血液流变学影响[J].中国中医药科技,2015,22 （3）∶317-318.

[10]邱卫东,杨晨雨.血府逐瘀汤加减对不稳定型心绞痛患者疗效及血浆超敏C反应蛋白的影响[J].中医临床研究,2012,4（6）∶14-15.

[11]王师菡,王阶,李霁,等.丹蒌片治疗痰瘀互阻型冠心病心绞痛的疗效评价[J].中国中西医结合杂志,2012,32（8）∶1051-1055.

[12]MitraS,GoyalT,MehtaJL.OxidizedLDL,LOX-1andatherosclerosis [J].CardiovascDrugsTher,2011,25（5）∶419-429.

[13]Vittos O,Toana B,Vittos A,et al.Lipoprotein-associated phospholipase A2（Lp-PLA2）:a review of its role and significance as a cardiovascularbiomarker[J].Biomarkers,2012,17（4）:289-302.

[14]Rosenson R S,Stafforini D M.Modulation of oxidative stress, inflammation,and atherosclerosis by lipoprotein-associated phospholipaseA2[J].JLipidRes,2012,53（9）∶1767-1782.

[15]Tellis C C,Tselepis A D.Pathophysiological role and clinical significance of lipoprotein-associated phospholipase A2（Lp-PLA2）bound to LDL and HDL[J].Curr Pharm Des,2014,20（40）∶6256-6269.

[16]WangWY,LiJ,YangD,etal.OxLDLstimulateslipoprotein-associated phospholipase A2 expression in THP-l monocytes via PI3K and p38MAPK pathways[J].Cardiovasc Res,2010,85（4）∶845-852.

（本文编辑：马雯娜）

Comparison of lipid metabolism and inflammatory reaction in atherosclerotic rats receiving treatment with Danlou tablets or Xuefu Zhuyu granules

CHEN Jie,MIAO Jing,XU Xiaoming,et al.Department of Cardiology,the First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310006,China
Corresponding author:MAO Wei,E-mail:maoweilw@163.com

ObjectiveTo investigate the effects of Chinese medicine Danlou tablets and Xuefu Zhuyu granules on blood lipid metabolism and inflammatory reaction in rat model of atherosclerosis.MethodsForty male Wistar rats were randomly divided into five groups,namely normal control group,model control group,atorvastatin group,Danlou group and Xuefu Zhuyu group.Normal control group was given basic forage,while other four groups were given high fat forage plus intraperitoneal injection of vitamin D3to establish atherosclerosis model,and then mRNAs in thoracic aorta of atorvastatin group and Danlou group were significantly decreased(all P＜0.05);and there were no significant differences between atorvastatin group and Danlou group(P＞0.05).Serum TC,IL-6,TNF-α,MCP-1 levels and expressions of IL-6,TNF-α,MCP-1 mRNA in thoracic aorta of Xuefu Zhuyu group were significant decreased (all P＜0.05)compared with model control group,while there were no significant differences in serum TG,LDL-C,ox-LDL, LP-PLA2 levels and expression of LP-PLA2 mRNA in thoracic aorta between two groups(P＞0.05).ConclusionBoth Danlou tablets and Xuefu Zhuyu granules can inhibit expression of inflammatory factors and relieve inflammatory reaction. Danlou tablets showed a stronger effect in regulating lipid metabolism than Xuefu Zhuyu granules.

intragastric administration of saline,atorvastatin suspension,Danlou tablet suspension and Xuefu Zhuyu granule suspension for 8 wk,respectively. After intervention,serum lipid and IL-6,TNF-α,MCP-1,ox-LDL,LP-PLA2 levels were measured by ELISA method,the expression of IL-6,TNF-α,MCP-1,LP-PLA2 mRNAs in thoracic aorta were detected by real-time fluorescent quantitative PCR(RT-fqPCR).ResultsCompared with normal control group,serum TC,TG,LDL-C,IL-6,TNF-α, MCP-1,ox-LDL and LP-PLA2 levels and the expressions of IL-6,TNF-α,MCP-1 and LP-PLA2 mRNAs in thoracic aorta of model group were significantly increased(all P＜0.05).Compared with model control group,serum TC,TG, LDL-C,IL-6,TNF-α,MCP-1,ox-LDL and LP-PLA2 levels and the expressions of IL-6,TNF-α,MCP-1 and LP-PLA2

Atherosclerosis;Inflammatory reaction;Lipid metabolism;Danlou tablets;XuefuZhuyu granules

浙江省中医药管理局基金项目（2014ZB043），吴阶平基金项目（320.6750.12397）

310006浙江中医药大学附属第一医院心内科，浙江中医药大学第一临床医学院（缪静）

毛威，E-mail:maoweilw@163.com

（2015-12-06）