高效液相色谱法同时测定芒果叶中芦丁与槲皮素含量

谢紫薇，李 强，刘 姗

（1.四川省成都市新都区中医医院，四川 成都 610500； 2.攀枝花学院，四川 攀枝花 617000）

高效液相色谱法同时测定芒果叶中芦丁与槲皮素含量

谢紫薇1，李 强2，刘 姗2

（1.四川省成都市新都区中医医院，四川 成都 610500； 2.攀枝花学院，四川 攀枝花 617000）

目的 建立同时测定芒果叶中芦丁、槲皮素含量的高效液相色谱（HPLC）法。方法 采用色谱柱Inertsil ODS－2柱(150 mm×4.6 mm，5 m)进行分析，流动相为70%甲醇－0.2%磷酸（65∶35），等度洗脱，体积流量为1.0 mL／min，检测波长为368 nm，柱温为35℃。结果 芦丁、槲皮素质量浓度均在1.464 48～120 g／mL（R2＝0.999 8，R2＝0.999 5）范围内与峰面积线性关系良好；平均回收率分别为100.08%和99.93%，RSD分别为1.12%和0.92%(n＝6）。结论 该方法可用于芒果叶的质量控制。

高效液相色谱法；芒果叶；芦丁；槲皮素

芒果叶为漆树科植物芒果 Mangifera indica L.的干燥叶[1]，其味酸、甘，性凉、平，具有行气疏滞、去痧积的功能，主要用于治疗热滞腹痛、气胀、小儿疳积、消渴等症[2]。现代研究表明，芒果叶提取物具有平喘、止咳、祛痰、抗炎、镇痛、抗菌、抗病毒、抗肿瘤等作用[3－4]，芒果叶中含有槲皮素、芦丁、抗坏血酸、鞣质、芒果苷、高芒果苷、异芒果苷、没食子酸等多种化学成分[3，5－6]。目前关于芒果叶化学成分含量测定的研究报道较少，仅见芒果苷、高芒果苷、没食子酸、总黄酮、多糖、多酚等的测定[7－12]。本研究中查阅文献[13－16]，建立了同时测定芒果叶中槲皮素与芦丁含量的高效液相色谱（HPLC）法，方法简便、准确，进一步完善了芒果叶的质量控制体系。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1200型高效液相色谱仪，包括四元泵（G1311A）、自动进样器 （G1313A）、柱温箱（G1316A）、VWD检测器（G1314A）、Agilent 1200 series色谱工作站（美国安捷伦科技有限公司）；FA2240B型电子天平（上海越平科学仪器有限公司）；SB120D型超声波提取仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）；KQ－200VDE型双频数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；SHB－Ⅲ型循环水式真空泵（南京予凯仪器设备有限公司）；旋转蒸发仪（上海青浦泸西仪器厂）；202型电热恒温干燥箱（北京中兴伟业仪器有限公司）；纯化水系统（成都吉尼水处理设备研究所）。

1.2 试药

槲皮素对照品（中国药品生物制品检定所，批号为10081－200501）；芦丁对照品（中国药品生物制品检定所，批号为10080－200707）；芒果叶采自攀枝花学院校园，经攀枝花学院刘姗副教授鉴定为漆树科植物芒果 Mangifera indica L.的叶。甲醇，磷酸（成都长联化工试剂有限公司）均为色谱纯；高纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：InertsilODS－2柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：70%甲醇－0.2%磷酸（65∶35），等度洗脱；体积流量：1.0 mL／min；检测波长：368 nm；柱温：35℃。在此色谱条件下的色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图

2.2 溶液制备

对照品溶液：称取芦丁3.0 mg，精密称定，置25 mL容量瓶中，用70%甲醇溶解并定容至刻度，标为①；从①中量取10 mL，置25 mL容量瓶中，用70%甲醇稀释并定容至刻度，标为②；同法依次配得溶液③～⑦。槲皮素对照品溶液同法配制。

供试品溶液：称取芒果叶样品粉末(过3号筛)0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，称定质量，超声(200 W，45 kHz)1 h，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，静置，取上清液，用0.22 μm有机微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3 方法学考察

线性关系考察：在拟订色谱条件下，将不同质量浓度对照品溶液分别进样10 μL，以对照品质量浓度(X，μg／mL)为横坐标，色谱峰面积(Y)为纵坐标，进行线性回归，回归方程为芦丁 Y＝17.787 X－8.595 4(R2＝0.9998)，槲皮素 Y＝65.207X－18.631(R2＝0.999 5)。结果表明，芦丁、槲皮素质量浓度在1.46448～120μg／mL范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：分别精密吸取2.2项下对照品溶液10 μL，注入色谱仪，在拟订色谱条件下连续进样6次。结果芦丁、槲皮素峰面积的 RSD分别为 0.27%和0.21%(n＝6)，表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一供试品溶液适量，0.22 μm微孔滤膜过滤后，分别于0，2，4，8，12，24 h时进样10 μL，在拟订色谱条件下进行测定。结果芦丁、槲皮素峰面积的 RSD分别为0.49%和0.72%(n＝6)，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

重复性试验：精密称取同一芒果叶样品粉末6份，每份约3.0 g，按2.2项下方法制备供试品溶液，0.22 μm微孔滤膜过滤后，在拟订色谱条件下进样10 μL。结果芦丁、槲皮素峰面积的 RSD分别为0.21%和0.23% (n＝6)，表明该方法重复性良好。

加样回收试验：称取已知含量的芒果叶样品粉末6份，每份约 0.25 g，精密称定，分别精密加入芦丁(37.75 μg／mL)对照品溶液1 mL、槲皮素(50.54 μg／mL)对照品溶液1 mL，依法制备供试品溶液，0.22 μm微孔滤膜过滤后，在拟订色谱条件下进样10 μL，记录峰面积，计算回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验结果（n＝6）

2.4 样品含量测定

称取3批芒果叶样品粉末，每批3份，每份0.5 g，精密称定，依法制备供试品溶液，0.22 μm微孔滤膜过滤后，在拟订色谱条件下进样10 μL，测定。结果见表2。

3 讨论

在优化芒果叶药材提取条件时，分别对提取方式（回流提取和超声提取）、提取时间、提取溶剂进行了考察。分别以20，40，60，80 min进行回流提取和超声提取。结果表明，随着提取时间的延长，芒果叶样品中2种成分的含量逐渐增大，但 60 min后逐渐呈下降趋势，从节约角度出发，最终确定以超声提取 60 min为最佳。在提取溶剂的考察中，分别考察了2，4，6，8，10倍量体积的水和甲醇，结果表明，10倍量的甲醇提取效果最佳。

表2 样品中芦丁和槲皮素含量测定结果（n＝3，mg／g）

芦丁、槲皮素经过紫外吸收波长测定后，分别以355，365，368 nm作为HPLC检测波长并进行比较。结果表明，在368 nm波长下，2种物质的检测灵敏度均较高，因此选择368 nm作为检测波长。

色谱条件优化时，分别考察了甲醇和乙腈作为色谱流动相有机相，结果显示，有机相为甲醇时，基线较平，干扰较小；考察了纯水、乙酸、甲酸、磷酸、磷酸缓冲溶液作为流动相水相，结果显示，磷酸可以显著提高分离效果，但过多的磷酸加入会明显增高基线。最终选择70%甲醇－0.1%磷酸（65∶35）为组成的流动相系统。经多次调整梯度洗脱程序，最终采用本研究中的梯度洗脱程序，能使所检测的芒果叶样品中这2种成分的色谱峰达到基线分离，峰形均较好，且分离度高。

芒果叶尚未被《中国药典》收载，目前收载于《广西中药材标准》[2]，尚无含量检测项。为进一步提升芒果叶的质量控制水平，有必要对芒果叶的主要有效成分进行测定。芦丁、槲皮素属黄酮类，均具有较好的生物活性，本研究中建立的方法可同时对以上2种成分进行分析，该方法稳定、准确、可靠，补充了现有文献对芒果叶化学成分含量测定的不足，可用于芒果叶的质量控制。下一步，可继续对芒果叶其余有效成分的测定进行研究，有助于更全面地控制芒果叶药材的质量。

[1]江苏新医学院.中药大辞典(上册)[M].上海:上海人民卫生出版社，1977:1 040.

[2]广西壮族自治区卫生厅.广西中药材标准[M].南宁:广西科学技术出版社，1992:54.

[3]邓家刚，曾春晖.芒果叶及芒果苷30年研究概况[J].广西中医学院学报，2003，6(2):44.

[4]刘雪萍，蒋伟哲，黄兴振，等.芒果叶提取物体外抗菌作用研究[J].中国药业，2007，16（9）:12－13.

[5]《全国中草药汇编》编写组.全国中草药汇编(下册)[M].北京:人民卫生出版社，1983：306.

[6]黄锁义，黎海妮，唐玉莲，等.超声波提取芒果叶黄酮[J].中国现代应用药学杂志，2006，23(6):455－456.

[7]冯 旭，王胜波，邓家刚，等.高效液相色谱法同时测定芒果叶中芒果苷与高芒果苷的含量[J].中成药，2008，30（10）: 1 504－1 506.

[8]侯小涛，戴 航，周丽霞.RP－HPLC测定4个品种芒果叶中的没食子酸[J].华西药学杂志，2008，23（1）:128.

[9]王晓波，刘冬英，邹志辉，等.芒果叶总黄酮含量及抗氧化作用测定[J].中国公共卫生，2013，29（7）:1 016－1 018.

[10]李金花，农石生，韦柳培，等.芒果叶多糖的提取及含量测定[J].食品研究与开发，2012，33（3）:135－137.

[11]文良娟，王 维，王 斌，等.芒果叶中黄酮和多酚含量及抗氧化性研究[J].食品工业，2013（1）:144－147.

[12]邓家刚，冯 旭，王 勤，等.不同产地及不同品种芒果叶中芒果苷的含量对比研究[J].中成药，2006，28（12）:1 755－1 756.

[13]王明星，于秀华，李焕荣，等.高效液相色谱法测定痔速宁胶囊中芦丁含量[J].中国药业，2006，15(8)：28.

[14]阳 华，王文渊，蒋小玲.反相高效液相色谱法测定心可舒颗粒中葛根素和芦丁含量[J].中国药业，2012，21（15）: 37－38.

[15]项贵贤 .反相高效液相色谱法测定金荞麦片中槲皮素含量[J].中国药业，2010，19(23）：29－30.

[16]陈 健.高效液相色谱法测定金钱草片中槲皮素和山柰素含量[J].中国药业，2016，25（6）:62－63.

Simultaneous Content Determination of Rutin and Quercetin in Folium M angiferae by HPLC

Xie Ziwei1,Li Qiang2,Liu Shan2
(1.Xindu Hospital of Traditional Chinese Medicine,Chengdu,Sichuan,China 610500; 2.Panzhihua University,Panzhihua,Sichuan,China 617000)

Objective To establish an HPLC method forthesimultaneouscontent determination of rutin and quercetin in Folium Mangiferae.M ethods The analysis was performed on Inertsil ODS－2 column (150 mm×4.6 mm,5 μm),mobile phase was 70% methanol－0.2% phosphoric(65∶35)with lsocratic elution,flow rate was 1.0 mL／min,detection wavelength was set at 368 nm,and column temperature was maintained at 35℃.Results The linear ranges of rutin and quercetin were 1.464 48－120 μg／mL(R2＝0.999 8,R2＝0.999 5),respectively.Their average recovery rateswere 100.08%(RSD＝1.12%,n＝6)and 99.93%(RSD＝0.92%, n＝6),respectively.Conclusion This method can be used for the quality control of Folium Mangiferae.

HPLC;folium mangiferae;rutin;quercetin

R284.1；R282.71

A

1006－4931(2016)21－0034－03

谢紫薇（1981－），女，硕士研究生，高级工程师，主要从事中药制剂质量评价研究，（电子信箱）657064681＠qq.com；刘姗（1980－），女，博士研究生，副教授，主要从事药用植物有效成分提取及药用植物分子生物学及基因工程研究，本文通讯作者，（电子信箱）9549057＠qq.com。

2016－06－11；

2016－07－07)