珙桐种子快速繁殖技术的研究

吴俊长，李 萌，曹福祥，吴林世，刘志明，邓飘云

（中南林业科技大学，湖南 长沙 410004）

珙桐种子快速繁殖技术的研究

吴俊长，李 萌，曹福祥，吴林世，刘志明，邓飘云

（中南林业科技大学，湖南 长沙 410004）

珙桐种子在自然条件下一般需要经过1～2年的休眠期才能萌发成苗，较长的休眠期限制了珙桐的繁殖能力。本研究以采集刚结出的珙桐种子为材料，利用种胚组织培养培育珙桐幼苗。研究从培养基成分、灭菌方式、激素配比、培养条件等方面分析了影响珙桐种子萌发和幼苗生长的因素。结果表明，在适合的条件下，当年产的珙桐种子可以跳过休眠期直接发育成苗。本研究为打破珙桐种子休眠，实现高效率、低成本快速育苗提供了理论基础。

珙桐；组织培养；种子休眠

珙桐Davidia involucrataBaill.是珙桐科珙桐属，第三纪古热带植物孑遗种，因其巨大的白色苞片形似白鸽，故又名鸽子树，具有很高的观赏价值、药用价值和科研价值。珙桐对生长环境要求苛刻，生存空间时时刻刻面临着威胁。同时因为休眠期长、种子败育等原因，其自然繁殖能力很低，已成为濒临灭绝的中国特有的树种，生长群落分布呈倒金字塔型。近年来由于乱砍滥伐、过度放牧、过度采摘等人为因素，珙桐的生长环境受到严重破坏，珙桐的群体数量逐渐减少，分布面积也逐渐缩小，保护珙桐资源并提高其自身繁殖能力是亟待解决的关键问题。

20世纪80年代以来，我国学者对珙桐开展了大量的研究，取得了一些进展。为了打破珙桐种子休眠，在育苗方面常采用机械破损种子法、变温处理法、化学试剂处理法、人畜尿液浸泡法、扦插、沙藏、湿砂层积法来处理种子[1-3]。牛文娟等[4]综合前人珙桐种子育苗的方法，总结出湿沙沉积法是提高珙桐种子萌发整齐度的最有效方法，与变温处理等其他方法结合效果更好，然而仍未有成型的工厂化育苗技术。珙桐等木本植物自然繁殖能力很低，种子内部含有某种抑制发芽的物质，且需要经历后熟过程，实生苗的培育需要较长的种子萌发期[5]。

木本植物的组培，存在着褐化的问题。褐化即酚污染，由植物的外植体变褐而死亡的现象。木质素、单宁、色素含量丰富的木本植物比草本植物就更容易发生褐化。不同种类植物的褐化情况不同[6-9]，而同一种植物，不同品种褐化率也不同[10]。珙桐组培的褐化率比较高，珙桐组培繁殖受到褐化而死亡的情况比较严重。

组织培养方面，研究人员选取珙桐的冬芽、根、茎、叶、胚、花药等为外植体，已进行愈伤组织的诱导[11-13]，种胚离体培养[14-15]，丛生芽的诱导[16-18]等培养方式。李月琴等[15]以成熟胚诱导愈伤组织，培育出幼苗，但分化率低，难以形成完整的植株，生产的幼苗率不太理想，褐化数量大，成本高。余阿梅等[14]把果实保存在河沙中层积一年，使其发育后进行组培诱导，但仍需一年时间，已成熟的果实经历了木质化，种壳坚硬，难以操作。并且，珙桐中经过切割处理的损伤部位极易产生致密氧化物而褐化，从而导致成活率下降。本研究在前人研究的基础上，在珙桐果实的选材、培养基成分的组成、灭菌方式和培养条件等因素上进行了优化，利用本研究提供的方法，可以从当年产的新鲜种子直接获得幼苗，跳过了休眠期，为珙桐快速繁育提供了基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

研究材料选用2014年6月采自张家界桑植县八大公山珙桐林的新鲜果实（未木质化）。清水洗净存放于4℃冰箱中待用。

培养基成分：WPM木本植物基本培养基，MS草本植物基本培养基和用于胚萌发的1/2MS+3 mg/LIBA+0.5 mg/L6-BA+1 mg/L GA3培养基、促进珙桐生芽的1/2MS+1.0 mg/L 6-BA培养基（以上培养基均含蔗糖20 g+琼脂粉6 g）

1.2 实验方法

（1）材料的测量记录：测量珙桐果实的长度、宽度、重量。以及计算出长宽比。

（2）外植体灭菌： 干热灭菌：在超净工作台上，用枪型镊子夹住珙桐果实在100%酒精灯上灼烧灭菌，灼烧时间不宜过长。化学灭菌：用75%酒精灭菌、0.1%升汞浸泡6～20 s，无菌水里冲洗3～4次。

（3）种胚的获得：用刀片在无菌环境下削除果肉，得到种胚。记录每个果实中的正常胚与败育胚。将正常胚分为去胚乳和未去胚乳两种类型。

（4）将带胚乳的胚放入以下配好的培养基中①WPM培养基； ②MS培养基； ③1/2MS激素培养基，而将去胚乳的胚放入WPM培养基。

（5）培养条件：12 h光照和12 h黑暗处理，温度24±3℃，光照强度2 000 lx，湿度约为65%。

1.3 数据处理

采用Excel 2007、SPSS19.0软件进行数据的统计与分析。

2 结果与分析

2.1 珙桐种子败育情况分析

对果实的重量、宽度、长度、长宽比、饱满胚个数（正常）、死亡胚个数（败育）、败育比做进行相关性分析，结果显示，珙桐果实的重量与长度、宽度均成极显著正相关，重量与长宽比呈极显著负相关；长度与宽度极显著正相关。一般比较饱满的珙桐果实中的种子营养物质比较充分，后期胚的发育过程中生命力比较顽强，生长状况比较好。种子大小在采集期（6月下旬）已经不再变化，后期果实和种子体积停止生长，而其内果皮逐渐木质化。刚形成的珙桐果实呈嫩绿色，去掉果肉后，正常发育的种子呈梭形，胚乳肥厚。珙桐果实内为8心皮结构，而自然条件中8个胚珠中往往只有1～2个能正常发育并最终成苗。相关性分析表明珙桐的重量与正常胚个数之间相关性不显著（表1）。

表1 珙桐种子的重量、长度、宽度、正常胚与败育胚的相关性分析†Table 1 Correlation analysis of Davidia involucrate seed weight, length, width, normal embryo and abortive embryos

2.2 珙桐果实的灭菌

本研究采用了 5种消毒方式共处理 60个外植体，20天后统计污染率，其中用 75%酒精或 0.1%升汞对外果皮灭菌 16～20 s后，再在无菌工作台上去果肉并接种，这种灭菌方式效果较差，后期污染严重。用 75%酒精或 0.1%升汞对去果肉的珙桐种胚灭菌 6～10 s，会导致种胚后期在培养基上生长的褐化程度及氧化程度增加（见表2）。

表2 不同消毒方式对于外植体的影响Table 2 Influence of different disinfection methods for explants

由于珙桐果实的果肉较厚。将珙桐果实直接在100%酒精灯上（700～1 000℃）快速、充分的灼烧，这样既快速灭菌，又未对种胚造成损害。且灼烧灭菌未发现有感染现象，说明这种灭菌方式更适合。

表3 珙桐在不同培养基的生长状况Table 3 Growth status of Davidia involucrate in different culture mediums

图1 去胚乳类的珙桐内种胚在WPM基本培养基的生长发育状况Fig.1 Growth and development status of Davidia involucrate embryo of removed the endosperm in the WPM basic medium

2.3 珙桐的生长状况

组培条件为 12 h光照和 12 h黑暗，温度为24±3℃，光照强度 2 000 lx，用空气加湿器控制湿度在 65%左右。将珙桐外植体分别接种于不同的培养基中，在培养一段时间记录结果（见表3）

去胚乳的种胚在不加任何激素的WPM上前期生长情况优于其他处理（如图1）。研究表明，如果内种胚完整，则会形成快速生长的珙桐幼苗。如果内种胚不完整，则会形成愈伤组织（见图2）。

将带胚乳的胚接种于WPM培养基上，外表面 2天后形成少许致密氧化物，些许褐化，15天后去掉胚乳，可以进入快速生长阶段（如图 3）。

珙桐胚（带胚乳）接种于激素MS培养基（1/2MS+3 mg/LIBA+0.5 mg/L6-BA+1 mg/L GA3）上，只有少数能形成愈伤组织，而大多数珙桐种子的表面氧化速度过快，里面内种胚的生长速度比外面的氧化速度慢，最终导致种胚未萌发，迅速被致密氧化物包裹而死亡（如图4，珙桐C）。珙桐胚（带胚乳）接种于可能诱导珙桐长芽的激素MS培养基内（1/2MS+1.0 mg/L 6-BA），结果与珙桐C类似（如图4，珙桐D）。珙桐胚（带胚乳）接种于原始MS基本培养基内，表面氧化速度较慢，里面营养物质不断积累，胚乳不断胀大，最后爆裂而出，但不能萌发，无法延续生长成完整的珙桐苗（如图4，珙桐E）。

图2 WPM基本培养基上去胚乳不完全：一半去胚乳，一半保留Fig.2 WPM basic culture medium: half out of endosperm,half remain

图3 未去除胚乳的珙桐胚在WPM基本培养基的生长发育状况Fig. 3 Growth and development status of Davidia involucrate embryo of not removed the endosperm in the WPM basic medium

图4 在不同的1/2MS培养基上珙桐胚（未去胚乳）的生长状况； E：珙桐胚（未去胚乳）在普通MS上的生长状况Fig. 4 Growth condition of Davidia involucrate embryo (not to endosperm) in different 1/2MS culture mediums.E:Growth condition of Davidia involucrate embryo (not to endosperm) in ordinary MS

3 讨 论

珙桐的繁殖困难，珙桐种子属双重休眠类型，由于珙桐核果的果核壁细胞高度木质化，增厚各组成分在三维空间排列，相互穿插、纵横交织、彼此嵌合，形成了果核壁的高强度结构，万朝琨[19]对休眠的珙桐种子进行解剖发现：由刚采收的珙桐种子的鱼雷形胚，经过层积处理后，可发育成成熟胚，反映出珙桐种子的胚有休眠的特性，这种坚硬而厚实的果核壁所具有的不吸水性和不透气性对珙桐种子的萌发起着明显的抑制作用。雷泞菲等[20]研究珙桐种子休眠期间内源激素的变化发现：随着珙桐种子的萌发，内源激素ABA、GA随着培根的伸长而逐渐升高，ABA/GA变化显著且珙桐的休眠与萌发可能有这两种激素拮抗调节。Urszula Krasuska[21-22]等用NO和HCN处理深度休眠的苹果胚发现：NO作为一种种子萌发调节激素能解除种子休眠机制，NO和HCN这两种化学试剂能在苹果胚中发生羰基化反应，解除苹果胚的休眠。

本研究发现珙桐带胚乳的种胚或者去胚乳的种胚在WPM基本培养基上，无需添加任何激素，都能稳定的萌发，带胚乳的珙桐胚在WPM培养基上早期发育较好，它能够吸收初期胚乳的营养，一段时间后，内种胚开始萌发时（有绿点冒出），其胚乳开始凋亡，在此阶段去除胚乳能促使种子进入快速发育阶段，扎根，长苗，打破原有的休眠期，培育出完整的幼苗。这与余阿梅[14]把种子放入河沙中层积一年，让胚发育一年的效果一致。

本研究还发现，采用珙桐去胚乳的胚接种入WPM基本培养基上，在前期胚能快速吸收培养基营养，快速萌发，但基础薄弱，长到一定阶段后，开始进入缓慢发育时期。胚初始阶段十分脆弱，易折断，造成不完全发育，不便于操作，难以获得完整的内种胚，如果一旦不完整，其生长紊乱并开始诱导而产生愈伤组织。从培养结果来看，珙桐具有很强的氧化机制和次生代谢物分泌功能，在受到外界条件刺激或损伤后极易褐化。有研究发现，褐化与外植体体内酚类物质的含量呈正相关，酚类的糖苷化合物是木质素、单宁或色素的合成前体[23-24]。使用1/2MS+3 mg/LIBA+0.5 mg/L 6-BA+1 mg/LGA3激素培养基和1/2MS+1.0 mg/L 6-BA培养基只有少部分能使种胚膨胀变大，发育成愈伤组织，大部分表面逐渐氧化，最终被粘稠状物质包裹而最终死亡，可能因为是MS培养基中大量元素含量过多，导致其营养比例在不加激素或激素不合适时朝愈伤组织发展[25-27]。

4 结 论

从本研究得出：取饱满、刚结出的果实，采取100%酒精灼烧灭菌，取带胚乳的种胚，接种于不加激素的WPM基本培养基中，生长一定时间后去掉外胚乳，能够完整、快速的生长。珙桐在组培培养基上褐化程度较高，导致珙桐组培成活率低，用根、茎、叶等培养愈伤组织较难。本研究提供的方法能迅速，高效率的得到珙桐苗，打破珙桐种子的自然休眠期，避免了组织培养中根、茎、叶等再生困难、生根率低成本高等一系列问题。

目前珙桐组培育苗技术可进一步发展成熟，研究其氧化机制，降低褐化程度，调整培养基成分，改善培养条件将是今后珙桐组培育苗的重点研究方向。

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Study on rapid propagation technology of Davidia involucrata seed

WU Jun-chang, LI Meng, CAO Fu-xiang, WU Lin-shi, LIU Zhi-ming, DENG Piao-yun
(Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China)

Davidia involucrataseeds have a dormancy period to germination and seedling survival of 1～2 years in natural conditions, so a long period of dormancy limits the reproductive ability ofDavidia involucrata. This study collectedDavidia involucrata’s seeds -just bear as materials, using embryo tissue culture technology to cultivate theDavidia involucrataseedlings.Research from the culture medium ingredient, sterilization, hormone proportion, culture conditions, etc, analysed the factors in fl uencing theDavidia involucrataseed germination and seedling growth. Results show that under suitable conditions, underyearlingDavidia involucrataseeds can skip dormancy directly develop into Plantlets. In this study, provided a theoretical basis for breaking theDavidia involucrataseed dormancy, realizing rapid seedling of the high ef fi ciency and low cost.

Davidia involucrate; tissue culture; seed dormancy

S792.99

A

1673-923X(2016)02-0066-05

10.14067/j.cnki.1673-923x.2016.02.012

http: //qks.csuft.edu.cn

2015-03-30

国家林业公益行业项目：湘鄂石漠化地区常绿阔叶林恢复研究（201104016）

吴俊长，硕士研究生

曹福祥，教授，博士，博士生导师；E-mail：csfucao@163.com

吴俊长，李 萌，曹福祥，等. 珙桐种子快速繁殖技术的研究[J].中南林业科技大学学报，2016, 36(2): 66-70, 95.

[本文编校：吴 彬]