优质绵羊冷冻胚胎引进及胚胎移植试验*

2016-12-20张新军刘长彬倪建宏万鹏程

新疆农垦科技 2016年11期

张新军，刘长彬*，倪建宏，万鹏程

（1.新疆生产建设兵团第七师一二七团畜牧服务中心，新疆奎屯833200；2.新疆农垦科学院畜牧兽医研究所/省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室）

优质绵羊冷冻胚胎引进及胚胎移植试验*

张新军1，刘长彬2*，倪建宏2，万鹏程2

2014—2015年先后从澳大利亚西奥谷河育种公司引进萨福克和肉用美利奴肉羊冷冻胚胎773枚。解冻后可用于移植的胚胎为739枚，移植受体羊739只。其中，A级胚胎553枚，B级胚胎186枚，且A级胚胎移植受胎率为50.27%（278/553），明显高于B级胚胎的39.25%（73/186），差异显著。同时，对比了大尾羊和细毛羊2种受体羊品种间的受胎率，结果为差异不显著。不同饲养条件下胚胎移植受胎率结果显示，全舍饲羊受胎率为39.56%（178/450），放牧羊受胎率为49.48%（143/289），两者差异显著。大规模进口肉羊冷冻胚胎进行移植在基层生产单位的成功应用，为肉羊产业发展提供了优良的种质资源。

绵羊；冷冻胚胎；胚胎移植

动物胚胎工程技术是家畜繁殖学领域的一项高新技术，既将良种母畜受孕后的早期胚胎通过人工方法取出，再将其移植到同种、同生理时期的母畜体内，并继续发育成新个体。胚胎移植亦称为受精卵移植，或称为“借腹怀胎”[1-2]。哺乳动物胚胎移植技术的发展已有100多年的历史。1890年，英国剑桥大学的Walter Heape在安哥拉兔上首次成功获得胚胎移植后代。美国的Warwick等在1934年成功进行了绵羊胚胎移植，该技术已发展了78年[3]。以引进动物冷冻胚胎的形式进行胚胎移植，不但节省人力、物力、财力，还可一次大量引进，而且可以把引种过程中疾病传播的几率降到最低限度[4]。马保华研究报道，供体与受体之间同期发情同步差在±1 d或0～24 h，胚胎移植受胎率较高，能够获得较为理想的胚胎移植效果[5-10]。

目前，中国许多省市、自治区等都已尝试进行大规模羊胚胎移植工程，并取得了一定的成绩。据统计，羊鲜胚胎移植妊娠率达54.4%～60.0%，最高达70.8%[11]。现将在2014—2015年进行的绵羊规模化冷冻胚胎移植试验进行总结。

1　材料与方法

1.1试验材料

1.1.1胚胎品种及来源

品种为萨福克和肉用美利奴羊，购自澳大利亚西奥谷河育种公司。

1.1.2供试动物

受体羊为2～5岁生殖系统健康、无传染病的本地大尾羊和新疆细毛羊。

1.1.3供试器材

拥有自主知识产权的羊专用手术架，腹腔内窥镜（OLYMPUS），实体显微镜（NIKON），Holding液、蔗糖液、冷冻液（ICP），CO2钢瓶（国产），恒温水浴锅，止血钳、手术刀、剪刀、持针钳、缝合针及线、创巾、工作服、注射器（1 mL、5 mL和20 mL）、先穴式胚胎移植管、一次性培养皿、温度计、布胶带、曲别针、碘酒及酒精、消毒液、抽纸等主要实验器材及耗材。

1.1.4供试药品

同期发情阴道海绵栓、孕马血清促性腺激素（PMSG，1 000 IU·瓶）、黄体酮、油剂青霉素、速眠新及苏醒灵（长春农牧大学军事兽医研究所）。

1.2方法

1.2.1胚胎鉴定

在体视镜下对解冻的胚胎进行分级鉴定，根据胚胎形态的完整性及内细胞团的致密程度分为A、B、C级。胚胎鉴定标准：（1）胚胎细胞团呈均匀对称的球形，形态典型，单个分裂球的大小、颜色、密度一致，轮廓清晰，胚胎发育阶段与预期的发育阶段一致者为A级；（2）胚胎细胞团的大小和形状以及单个细胞的颜色和密度存在一定的不规则，细胞质较致密，分布均匀，具有完好的、具活性的胚胎细胞团者为B级；（3）胚胎细胞团的大小和形状以及单个细胞有明显变异，分裂球轮廓稍不清晰，或部分不清晰，细胞质不致密，分布不均匀，色调发暗，但仍有部分细胞结构是完好的、有活性的胚胎细胞团者为C级。

1.2.2胚胎移植

采用微创手术，用移胚针将符合质量要求的胚胎移植到与胚胎胚龄同期化的受体羊子宫角内，移植后立即颈部肌肉深部注射黄体酮1 mL。

1.2.3妊娠检查

于胚胎移植后45～60 d进行B超检查，统计受胎率。

1.2.4试验资料的统计与分析

试验数据采用卡方检验进行差异显著性分析。

2　结果

2.1不同胚胎级别对受体受胎率的影响

在本试验中，共解冻了引进冷冻胚胎773枚，达到移植级别的胚胎739枚，C和D级胚胎34枚，占可移植胚胎的4.6%（34/739）；将可移植胚胎用于移植后，A级胚胎受胎率为50.27%（278/553），B级胚胎为39.25%（73/186），两者之间差异显著（P＜0.05），见表1。

表1　冷冻胚胎解冻后胚胎级别分布及移植受胎率情况

2.2不同品种受体羊的受胎率分析

本试验共处理了274只羊，大尾羊发情率为91.36%（148/162），细毛羊发情率96.43%（108/112）；大尾羊移植受胎率36.49%（54/148），细毛羊移植受胎率42.59%（46/108）。从表2可以看出，在相同的同期发情处理方式下，在同期发情效率上差异不显著（P＞0.05），2个品种间的受胎率同样差异不显著（P＞0.05），见表2。

2.3不同饲养方式对受体受胎率的影响

表2　不同绵羊品种对受胎率的影响

本试验共移植了受体739只，其中全舍饲羊450只，放牧羊289只。全舍饲羊受胎率为39.56%（178/450），放牧羊受胎率为49.48%（143/289），放牧饲养管理条件下的受体羊获得更高的受胎率，差异显著（P＜0.05），见表3。

表3　不同饲喂方式对绵羊受体受胎率的影响

3　结论

胚胎的冷冻对胚胎是一种伤害，因此，在冷冻前必须选择A级胚胎进行冷冻，以确保解冻后的胚胎能够维持A级或B级的分级级别，才能有效保障受体羊获得更高的移植受胎率。从表1可以看出，A级胚胎经冷冻解冻后获得了50.27%（278/553）的受胎率，而B级胚胎冷冻解冻后获得了39.25%（73/186），两者之间差异显著（P＜0.05）。冷冻试验的C和D级冷冻胚胎解冻后，内细胞团散、透明带破裂和解冻后找不到明显的胚胎等情形，而无法进行胚胎移植，因此，C和D级胚胎不用于冷冻，如果有条件可以直接鲜胚移植。

受体羊同期发情效率的高低是影响胚胎移植效率的关键因素之一，一般情况下，同期发情效率受季节、营养、处理方案、药物等的影响。本试验中对2种受体羊品种进行了同期发情处理，采取每天观察2次，每次观察发情时间30 min至1 h，且看到受体羊表现为爬跨静立、外阴出现红肿、流透明粘液和精神不安等即判断为发情[12]。从表2可以看出，大尾羊与小尾羊的发情效率相当，差异不显著。经过胚胎移植后，两组的受胎率差异同样不显著。

从表3可以看出，放牧绵羊的受胎率高于全舍饲，主要是因为放牧羊能够充分运动，再者是放牧羊能够采食到优质的新鲜牧草、牧草果实或优质干草。由于放牧羊能够获得更为全面的维生素、微量元素和蛋白的营养供应，因此，放牧羊的移植受胎率明显高于全舍饲羊的受胎率，差异显著（P＜0.05）。

综上所述，绵羊胚胎移植是一个系统工程，其受体选择、激素、时间、季节和管理与营养等一系列环节紧密相扣，任何一个环节出现问题都将导致胚胎移植失败。只有做到精心挑选受体、严格操作、无菌措施以及精准移植等，胚胎移植工作才能收到满意效果。

[1]傅文栋，李风德，牛建克.绵羊胚胎移植研究进展[J].黑龙江动物繁殖，2010，（18）5：20-21.

[2]侯引绪.绵羊胚胎移植产业化技术研究[D].北京：中国农业大学，2006.

[3]肖西山，程鹏，李玉冰，等.胚胎移植在家畜生产中的应用[J].北京农业职业学院学报，2004，60（18）：26-28.

[4]李铭，黄恒，张立，等.绵羊规模化胚胎移植试验效果与分析[J].中国农学通报，2010，26（17）：17-19.

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[7]李键，马保华，张红，等.胚胎移植不同品种受体羊同期发情研究[J].西南农业学报，2005，18（3）：343-347.

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[10]陈卓，谷红伟，方治中，等.肉羊二细胞期胚胎（二分胚）移植试验研究[J].甘肃畜牧兽医，2016，46（11）：83-85.