两株芽孢杆菌对萘、菲、芘的降解特性研究

雒晓芳，温文静，谭丽婵，王 婵，张 巍，熊 梅，龙子杨

（1.西北民族大学实验中心，甘肃兰州730030；2.西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730030）

两株芽孢杆菌对萘、菲、芘的降解特性研究

雒晓芳1，温文静2，谭丽婵2，王 婵2，张 巍2，熊 梅2，龙子杨2

（1.西北民族大学实验中心，甘肃兰州730030；2.西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730030）

目的：研究枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌在不同pH、温度和盐度条件下对多环芳烃萘、菲、芘的降解.方法：将多环芳烃萘、菲、芘做为惟一碳源，以活性炭为吸附载体，通过实验测定菌株对萘、菲、芘的降解能力和脱氢酶活性大小，为进一步研究多环芳烃的降解提供理论依据.结果：两株芽孢杆菌在不同的温度、pH、盐度下培养48h后，得到各单因素的最适降解条件为温度在35℃（pH＝7.0、盐度为80mmol／L）时，枯草芽孢杆菌对萘、菲、芘的降解率和脱氢酶活性达到最高.在温度为30℃（pH＝7.0、盐度为40mmol／L）时，苏云金芽孢杆菌对萘、菲、芘的降解率和脱氢酶活性达到最高.结论：枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌在不同的温度、酸度和盐度条件下对萘、菲、芘的降解能力和脱氢酶活性各不相同，其中，酸度对枯草芽孢杆菌的影响最大，温度对苏云金芽孢杆菌的影响最大.而在相同条件下，两种菌株对萘、菲的降解能力和脱氢酶活性均大于对芘的降解能力和脱氢酶活性，可见萘和菲的降解效果比芘的降解效果好.

枯草芽孢杆菌；苏云金芽孢杆菌；降解率；脱氢酶活性

多环芳烃是指分子中的苯环含有2个以上所组成的碳氢化合物，如萘、蒽、菲、芘、三联苯等［1］.许多多环芳烃都具有生物毒性以及难降解性，并且还具有生物累积性［2］，对人类和动物的生存及健康造成了很大的威胁.绝大多数的多环芳烃［3］是一种呈淡黄色或者无色的结晶，只有少数呈深色，具有较高的熔沸点，并且具有很小的蒸汽压，在水中很难溶解.多环芳烃能够使人发生畸变、导致人类发生癌变、致基因突变，对人类健康的危害极大［4］.土壤中的多环芳烃污染，是国外最早的研究方向.这个项目主要研究的是多环芳烃的来源、土壤中的迁移特性，环境行为的物理和化学的关系［5］.有研究表明，多环芳烃降解后产生的脱氢酶量、脱氢酶活性表现出同步变化关系，并随着污染物的降解环境因素变化生物降解效率改变［6］，因而可以通过抑制降解菌的生长而影响、考察生物降解过程［7］.环境因素会影响微生物的活性，进而影响降解效果［8］.影响的因素有温度、氧气、水分、pH值等.多环芳烃具有相对稳定的性质，虽然微生物有自然降解的能力，但是速度会变的非常慢.因此，需要通过人工的手段，来改变微生物的生活环境.加强微生物降解的能力，加快降解多环芳烃的速度，达到减少环境中多环芳烃的影响［9］.

本实验主要以枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌对萘、菲、芘的降解率和脱氢酶活性作为评价指标，研究在不同的pH值、温度和盐度条件下，两株菌降解萘、菲、芘的能力，进而掌握两株菌在不同因素作用下对萘、菲、芘的最适降解条件，对微生物降解多环芳烃的实际应用提供理论依据.

1 菌种来源

实验中使用的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）是由西北民族大学实验中心微生物实验室分离得到.

1.1 主要试剂

萘、菲、芘、活性炭、环己烷（以上试剂均为分析纯）、氢氧化钠、盐酸、氯化三苯基四氮唑、甲苯、浓硫酸.

1.2 主要培养基

无机盐培养基、营养肉汤培养基（杭州微生物试剂有限公司）.

2 实验方法

2.1 实验准备

取若干个50mL的锥形瓶，在锥形瓶中分别加入10g活性炭和0.5g萘、菲、芘.往锥形瓶中加入适量环己烷溶液将物质溶解，待环己烷完全挥发备用.

2.2 不同培养条件下菌株对萘、菲、芘的降解率及脱氢酶活性

加入10mL的菌液在处理好的萘、菲、芘三角瓶中，根据表1在相应的因素及水平条件下分别振荡培养48h后，测定萘、菲、芘的降油率和脱氢酶活性，并作图比较.

表1 试验因素及水平

2.3 萘、菲、芘标准曲线的绘制

萘、菲、芘标准曲线的绘制参照汪如婷等的标准曲线的计算方法进行［10］.

3 结果与分析

3.1 不同培养条件下菌株对萘、菲、芘的降解

图中A、B分别表示枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌.

图1 不同pH条件下枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌对萘、菲、芘降解率的影响

由图1（a－b）可知，pH值对多环芳烃的降解率具有较大的影响.当pH不同时，菌株对同一底物在不同pH条件下的降解效果差异很大.当pH＜7.0时，枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌对萘、菲和芘降解率随之降低.当pH＝7.0时两株芽孢杆菌对三种不同的多环芳烃降解效果最好 .枯草芽孢杆菌对萘、菲、芘的降解率分别为：25.5%、33.7%、22.5%.苏云金芽孢杆菌对萘、菲、芘的降解率分别为：15.3%、14.6%、12.2%.当pH＞7.0时，随着pH的升高，枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌对萘、菲、芘的降解率也随之降低.因此，两种菌株对多环芳烃降解的最佳pH为7.0，且枯草芽孢杆菌对同种多环芳烃的降解效果优于苏云金芽孢杆菌.

图2 不同温度条件下枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌对萘、菲、芘降解率的影响

由图2（a－b）可知，温度对枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌降解多环芳烃具有较大的影响.随着培养温度的升高，菌株对萘、菲、芘的降解效果均上升.当温度为35℃时，枯草芽孢杆菌对萘、菲、芘的降解率分别为：24.3%、28.2%、20.5%.在温度为30℃时，苏云金芽孢杆菌对萘、菲、芘的降解率分别为：18.75%、16.3%、12.1%.当培养温度在继续升高时，枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌对萘、菲、芘的降解率也随之降低.因此，枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌对多环芳烃降解的最佳温度分别为35℃和30℃，且枯草芽孢杆菌对同种多环芳烃的降解效果优于苏云金芽孢杆菌.

图3 不同温度条件下枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌对萘、菲、芘降解率的影响

由图3（a－b）可知，盐度对枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌降解多环芳烃具有较大的影响，且两种菌株对萘、菲、芘的最适降解盐度有所不同.随着盐度的升高，枯草芽孢杆菌对萘、菲、芘的降解均上升.当盐度为80mmol／L时对多环芳烃的降解率达到最大，对萘、菲、芘的降解率分别为：24.2%、27.1%、21.3%.当盐在继续升高时，枯草芽孢杆菌对萘、菲、芘的降解率将随之降低.盐度为40mmol／L～80 mmo／L时，苏云金芽孢杆菌对萘、菲、芘的降解率比较稳定.当盐度为40mmol／L时，苏云金芽孢杆菌对萘、菲、芘的降解率分别为：16.6%、15.1%、12.2%.当盐度继续升高时，苏云金芽孢杆菌对萘、菲、芘的降解率随之降低.因此，枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌对多环芳烃降解的最佳盐度分别为80 mmol／L和40mmol／L，且枯草芽孢杆菌对同种多环芳烃的降解效果优于苏云金芽孢杆菌.

图4 不同pH条件下枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌对萘、菲、芘脱氢酶活性的影响

3.2 不同培养条件下菌株对萘、菲、芘的脱氢酶活性

图4（a－b）为萘、菲、芘在不同pH值条件下脱氢酶活性的变化.结合图1（a－b）可以看出，脱氢酶活性与降解率变化趋势基本相同，脱氢酶活性与降解率之间可能存在一定相关性.脱氢酶活性的提高表明微生物生物活动频繁，有利于多环芳烃的生物降解.在pH为5.0～7.0时，脱氢酶活性的升高趋势较为明显，同时降解率的增加也有明显变化.当pH值为7.0时，二者的脱氢酶活性均达到最高值，此时两株芽孢杆菌对三种不同的多环芳烃降解效果最好.枯草芽孢杆菌对萘、菲、芘的脱氢酶活性分别为：35.4（ug·mL－1）·h、32.1（ug·mL－1）·h、29.3（ug·mL－1）·h，苏云金芽孢杆菌对萘、菲、芘的脱氢酶活性分别为：28.1（ug·mL－1）·h、22.1（ug·mL－1）·h、18.1（ug·mL－1）·h.当pH＞7.0时，随着pH的升高，枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌对萘、菲、芘的脱氢酶活性也随之降低.因此，选择最佳pH值为7.0为宜.

图5 不同温度条件下枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌对萘、菲、芘脱氢酶活性的影响

图5为萘、菲、芘在不同温度条件下脱氢酶活性的变化.由图5（a－b）可知，温度对枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌降解多环芳烃具有较大的影响.随着培养温度的升高，菌株对萘、菲、芘的脱氢酶活性均上升.当温度为35℃时，枯草芽孢杆菌对萘、菲、芘的脱氢酶活性分别为：33.3（ug·mL－1）·h、38.3（ug·mL－1）·h、31.5（ug·mL－1）·h.在温度为30℃时，苏云金芽孢杆菌对萘、菲、芘的脱氢酶活性分别为：29.1（ug·mL－1）·h、25.0（ug.mL－1）·h、22.2（ug·mL－1）·h.当培养温度在继续升高时，枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌对萘、菲、芘的脱氢酶活性也随之降低.因此，枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌的最佳温度分别为35℃和30℃为宜.

图6 不同盐度条件下枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌对萘、菲、芘脱氢酶活性的影响

图6（a－b）为萘、菲、芘在不同盐度条件下脱氢酶活性的变化.结合图3（a－b）可以看出，脱氢酶活性与降解率变化趋势基本相同，脱氢酶活性与降解率之间可能存在一定相关性.由图6（a－b）可知，盐度对枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌降解多环芳烃具有较大的影响，且两种菌株对萘、菲、芘的最适降解盐度有所不同.随着盐度的升高，枯草芽孢杆菌对萘、菲、芘的脱氢酶活性均上升，当盐度为80mmol／L时对多环芳烃的脱氢酶活性达到最大，对萘、菲、芘的脱氢酶活性分别为：32.3（ug·mL－1）·h、34.1（ug·mL－1）·h、28.2（ug·mL－1）·h.当盐度继续升高时，枯草芽孢杆菌对萘、菲、芘的脱氢酶活性将随之降低.盐度为40mmol／L～80mmo／L时，苏云金芽孢杆菌对萘、菲、芘的脱氢酶活性比较稳定.当盐度为40mmol／L时，苏云金芽孢杆菌对萘、菲、芘的脱氢酶活性分别为：28.6（ug·mL－1）·h、26.5（ug·mL－1）·h、24.2（ug·mL－1）·h.当盐度在继续升高时，苏云金芽孢杆菌对萘、菲、芘的脱氢酶活性将随之降低.因此，枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌的最佳盐度分别为80mmol／L和40mmol／L为宜.

4 结论

1）本实验以多环芳烃中萘、菲、芘为惟一碳源，在同一培养条件下脱氢酶活性曲线图与降解率曲线图的变化趋势基本相同.

2）在不同pH、温度、盐度条件下，菌株对同一底物的降解效果不同，且枯草芽孢杆菌对同种多环芳烃的降解效果优于苏云金芽孢杆菌.

3）两种菌株对萘、菲的降解能力和脱氢酶活性均大于对芘的降解能力和脱氢酶活性.

4）枯草芽孢杆菌降解多环芳烃萘、菲、芘的最适降解温度为35℃，最适降解pH为7.0，最适降解盐度为80mmol／L；苏云金芽孢杆菌降解多环芳烃萘、菲、芘的最适降解温度为30℃，最适降解pH为7.0，最适降解盐度为40mmol／L.

5）由图1～6可知，pH、温度、盐度都会影响芽孢杆菌对多环芳烃萘、菲、芘的降解.其中，酸度对枯草芽孢杆菌的降解效果最大，温度对苏云金芽孢杆菌的降解效果最大.因此，选择最适的降解条件，可为萘、菲、芘等多环芳烃的降解研究提供理论依据，从而实现对多环芳烃的最大程度的降解.

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Study on Degradation Characteristics of Naphthalene，Phenanthrene and Pyrene by two Strains of Bacillus

LUO Xiao-fang1，WEN Wen-jing2，TAN Li-chan2，WANG Chan2，ZHANG Wei2，XIONG Mei2，LONG Zi-yang2
（1.Center of Experiment，Northwest University for Nationalities，Lanzhou 730100，China；2.College of Life Science and Engineering，Northwest University for Nationalities，Lanzhou 730100，China）

Objective The present study aimed to investigate the degradation properties of polycyclic aromatic hydrocarbon naphthalene，phenanthrene and pyrene by Bacillus subtilis and Bacillus thuring－iensis under the different pH，temperature and salinity conditions.Methods Taking naphthalene，phenanthrene and pyrene as the unique source of carbon，and selected the ctivated carbon as adsorbent，the degradation ability and dehydrogenase activity of naphthalene，phenanthrene and pyrene were determined in this experiment.Results Both Bacillus subtilis and Bacillus thuringiensis strains were cultured under different temperature，acidity and salinity at 48h.Optimal degradation condition for each single factor was obtained.At a temperature of 35℃（pH＝7.0，salinity 80mmol／L），the degradation rate of naphthalene，phenanthrene and pyrene by Bacillus subtilis was the highest.the degradation rate of naphthalene，phenanthrene and pyrene by Bacillus thuringiensis was the largest at 30℃（pH＝7.0，salinity 40mmol／L）.Conclusion Bacillus subtilis and Bacillus thuringiensis had different degradation efficacy for naphthalene，phenanthrene and pyrene under the different conditions of temperature，acidity and salinity，additionally to dehydrogenase activity.Acidity and temperature had maximum effects on Bacillus subtilis and Bacillus thuringiensis，respectively.Howvere，Bacillus subtilis and Bacillus thuringiensis indued a higher degradation ability and dehydrogenase activity of naphthalene and phenanthrene than that of pyrene.It is showed that degradation effect of naphthalene and phenanthrene was better than that of pyrene.

Bacillus subtilis；Bacillus thuringiensis；Degradation rate；Dehydrogenase activity

X131.3

A

1009-2102（2016）03-0046-05

2016-08-20

2016年开放项目（SYSKF－2016228）.

雒晓芳（1980—），女，宁夏泾源人，硕士，副教授，主要从事环境微生物研究.