壬基酚对一株铜绿假单胞菌吸附镉的影响

魏 蓝,朱月芳,史广宇,何 理,陈 昱,施维林*(.苏州科技大学环境科学与工程学院,江苏 苏州5009；.苏州市环境监测中心,江苏 苏州 5004；.华北电力大学可再生能源学院,北京 006)

壬基酚对一株铜绿假单胞菌吸附镉的影响

魏 蓝1,朱月芳2,史广宇1,何 理3,陈 昱1,施维林1*(1.苏州科技大学环境科学与工程学院,江苏 苏州215009；2.苏州市环境监测中心,江苏 苏州 215004；3.华北电力大学可再生能源学院,北京 102206)

考察壬基酚(NP)对一株从重金属污染场地筛选出的铜绿假单胞菌X吸附镉(Cd)的影响,在NP浓度分别为0、1.0、10.0mg/L条件下,通过优化吸附条件,研究X菌的Cd2+吸附效果.结果表明,NP与Cd2+共存时,在Cd2+初始浓度为1.0mg/L的溶液中,菌体的最佳投菌量和pH值为1.0g/L和7.0,吸附2h,吸附率可达90.0 %左右.失活菌与活菌的吸附结果表明失活菌的吸附能力较活菌强.NP浓度对吸附的影响结果表明,低浓度NP对菌株吸附Cd2+的抑制作用较小,高浓度NP时抑制作用较大.通过分析X菌处理单一Cd2+及Cd2+-NP复合污染后的红外光谱图可知,菌体表面的羟基O—H键、酰胺C—N键和N—H键和氨基均参与吸附反应,并且高浓度NP对菌体表面基团活性影响较大,从而影响其对Cd2+的吸附.

壬基酚；镉；铜绿假单胞菌X；吸附；表面基团

镉(Cd)作为工农业使用的原料被广泛用于电镀、合金、杀虫剂和电池制造等行业,其以“三废”形式进入环境,从而导致 Cd污染严重超标,现行管理对其治理要求较为严格.传统的物理和化学方法尽管能够有效去除土壤中的Cd,但投资较大,且易形成二次污染等问题[1-6].相比于传统的重金属污染治理方法,生物吸附技术因其具有高效价廉、无二次污染、操作简单、可用性强等特点,已成为国内外研究的热点[7-10].其中,微生物作为首选吸附材料,治理效果较好[11],并且研究

表明,微生物菌体在 Cd处理方面具有良好的活性和吸附效果[12-15].

然而,重金属污染往往是和其他污染物共存,形成复合污染.壬基酚(NP)作为一种工业使用表面活性剂的降解产物,传统和深度的废水处理方法无法将其去除,最终在环境各圈层循环[16-18].生物法处理有机物-重金属复合污染是个难点,有关NP-Cd复合污染的研究几乎没有.文章通过对物化因素的控制,旨在找到 NP存在下微生物对Cd2+的最佳吸附条件,并探究在不同浓度 NP下菌体对Cd2+的吸附效果.

1 材料及方法

1.1 实验材料

实验菌株：筛选自苏州地区典型污染土壤,经16S rRNA序列比对,鉴定为铜绿假单胞菌,菌株编号为 X,预实验结果表明在吸附 2h,菌浓度为1.0g/L,pH为7.0且初始Cd2+浓度小于1.0mg/L时,吸附率在80 % ～ 90 %之间,表明其对Cd2+有较好的吸附效果.

营养培养基：牛肉膏 5.0g、蛋白胨 10.0g、NaCl 5.0g、去离子水1000mL、pH=7.0±0.3.

试剂：Cd标准储备液 1000mg/L,由分析纯CdCl2溶于去离子水得到;NP储备液 1000mg/L,由优级纯 NP(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)溶于无水乙醇得到.

1.2 实验方法

1.2.1 菌悬液的制备 将已知菌接种于灭菌培养基中,于 30℃,150r/min恒温摇床中振荡培养24h后作为母液,4℃冷藏保存.用无菌操作技术将母液以 1%的接种量接种于灭菌培养基内,在上述条件下培养16h至对数生长期,5000r/min离心10min,去上清后,用去离子水清洗3次,称重后制成菌悬液,备用.

1.2.2 吸附条件优化实验 (1)吸附时间与 NP浓度对菌体吸附Cd2+的影响

分别添加对数生长期菌悬液于 NP浓度为0,1.0,10.0mg/L,pH为7.0的1.0mg/L的Cd溶液中,控制菌浓度为1.0g/L,溶液总体积为20mL,以不加菌作空白对照.振荡培养 0.5,1,2,4,8,12,24h时分别取样,5000r/min离心 10min,取上清过0.45µm水系滤膜,采用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)测定Cd2+浓度.

(2) Cd2+初始浓度与 NP浓度对菌体吸附Cd2+的影响

分别添加对数生长期菌悬液于 NP浓度为0,1.0,10.0mg/L,pH值为7.0的0.1,0.5,1.0,5.0,10.0, 50.0mg/L的Cd溶液中,控制菌浓度为1.0g/L,溶液总体积为 20mL,以不加菌作空白对照.振荡培养2h取样,其余操作同上.

(3) 投菌量与NP浓度对菌体吸附Cd2+的影响

分别添加对数生长期菌悬液于 NP浓度为0,1.0,10.0mg/L,pH值为7.0的1.0mg/L的Cd溶液中,控制菌浓度分别为 0.5,1.0,1.5,2.0,2.5g/L,溶液总体积均为 20mL,以不加菌作空白对照.振荡培养2h取样,其余操作同上.

(4) pH与NP浓度对菌体吸附Cd2+的影响

分别添加对数生长期菌悬液于 NP浓度为0,1.0,10.0mg/L,pH值为3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0的1.0mg/L的Cd溶液中,控制菌浓度为1.0g/L,溶液总体积为 20mL,以不加菌作空白对照.振荡培养2h取样,其余操作同上.

1.2.3 活菌与失活菌吸附 Cd2+的差异 将扩大培养至对数生长期的菌体用2.5%的戊二醛固定,冷藏避光保存 24h,使菌体失活,离心后制成菌悬液,同时制备对数生长期活菌悬液.分别添加菌悬液于NP浓度为0,1.0,10.0mg/L,pH值为7.0的1.0mg/L的Cd溶液中,控制菌浓度为1.0g/L,溶液总体积为 20mL,以不加菌作空白对照.振荡培养2h取样,其余操作同上.

1.2.4 不同 NP浓度对菌体吸附 Cd2+的影响将对数生长期菌悬液分别投加到 NP浓度为 0, 0.1,0.5,1.0,5.0,10.0,50.0mg/L,pH 值为 7.0 的1.0mg/L的Cd溶液中,控制菌浓度为1.0g/L,溶液总体积为 20mL,以不加菌作空白对照.振荡培养2h取样,其余操作同上.

1.2.5 红外光谱分析 分别添加对数生长期菌悬液于NP浓度为0,1.0,10.0mg/L,pH值为7.0的1.0mg/L的Cd溶液中,控制菌浓度为1.0g/L,溶液总体积为 20mL,以不加 Cd2+的纯菌悬液作空白

对照.振荡培养2h取样,5000r/min离心10min,弃上清.将菌体移入2mL离心管中,10000r/min离心10min,弃上清后置于冷冻干燥机内冷冻 12h.取出后进行KBr压片,采用傅立叶红外光谱仪进行分析.

1.3 数据处理

式中：R为菌株对Cd2+的吸附率,%;C0为测得溶液中的初始 Cd2+浓度,mg/L;Ce为测得的反应后溶液中的Cd2+浓度,mg/L;Q为单位质量菌株对Cd2+的吸附量,mg/g;V为溶液体积,L; m为菌株质量,g.

2 结果与讨论

2.1 吸附时间与NP浓度对菌体吸附Cd2+的影响

吸附时间是微生物吸附重金属的重要参数之一.图1所示为吸附时间与NP浓度对Cd2+吸附的影响.由图1可知,无NP时,0.5h内X菌吸附了体系中大部分 Cd2+,吸附率约为 80.2%,随时间的推移,吸附率波动较小,在8h时基本趋于稳定.当体系中加入NP后,菌体对Cd2+的吸附率低于空白值,且吸附率下降速度先快后慢.不同NP浓度相比,NP对菌体的Cd2+吸附率在2h前无明显抑制差异,在 2h时开始出现抑制差异并逐渐增大,故将其作为后续实验中的最适吸附时间.

生物吸附重金属普遍存在两个时期,一是快速吸附时期,一般在几十分钟内即可吸附 70.0%左右的重金属,此时主要进行菌体的表面吸附,因此速率快;二是缓慢时期,耗时约为快速吸附的几十倍甚至更多,因为细胞膜具有磷脂双分子层,而金属离子需依靠载体才能实现跨膜运输进入胞内,在胞内富集,该过程耗能且受细胞代谢和扩散过程影响,所以吸附速率慢[19].在NP和Cd复合污染体系中,两种污染物一方面通过影响细胞膜的通透性,使其对菌体的毒性增强;另一方面通过影响微生物活性及生长来影响吸附效果[20].

图1 吸附时间与NP浓度对X菌吸附Cd2+的影响Fig.1 Effect of contact time and NP concentration on the biosorption of Cd2+by bacteria X

2.2 Cd2+初始浓度与 NP浓度对菌体吸附Cd2+的影响

图2所示为Cd2+初始浓度和NP浓度影响微生物吸附的结果.吸附时间为 2h,随 Cd2+浓度的增加,对照组单位质量菌体的吸附量由缓慢上升至快速上升,吸附率从无明显变化至快速下降,在1.0mg/L时达到最大,基本清除了体系中的 Cd2+,此时吸附效果最佳.加入NP后,不同NP浓度对菌体吸附 Cd2+的能力影响甚微.与对照组相比,在Cd2+浓度为 0.1～1.0mg/L时,吸附率有明显降低趋势,且差值随Cd2+浓度的升高而减小,吸附量相对于对照组变化不明显.当 Cd2+浓度为 5.0～50.0mg/L时,吸附效率均比未添加NP体系明显提高.

综上所述,高浓度 Cd2+会抑制生物对其的吸附作用,NP和 Cd2+的联合抑制作用在Cd2+浓度低时最显著.单独 Cd2+作用时,在高 Cd2+浓度下,由于 Cd总量较大,故总体吸附率降低;单位质量菌体的吸附量逐渐升高,是由于菌体颗粒与流体相之间的传质驱动力的提高,以及吸附质和吸附剂的碰撞次数的增多[21].与对照组相比,加入 NP后,对低浓度Cd2+的吸附抑制可能是因为NP与Cd2+竞争菌体表面的吸附位点以及NP的毒性抑制.而添加NP体系中,高浓度Cd2+吸附率均大于

对照组,可能是由于菌体代谢NP后,菌体的表面变褶皱,更粗糙,比表面积增大,吸附点位增多,从而提高了吸附效果[22].

图2 Cd2+初始浓度与NP浓度对X菌的Cd2+吸附率(柱状图)及单位质量X菌的Cd2+吸附量(折线图)的影响Fig.2 Effect of initial Cd2+concentration and NP concentration on the biosorption rate of Cd2+by bacteria X (histogram) and on Cd2+uptake capacity by unit mass of bacteria X (line chart)

2.3 投菌量与NP浓度对菌体吸附Cd2+的影响

投菌量也是影响生物吸附重金属的重要指标之一.图 3表明,不加 NP,初始 Cd2+浓度为1.0mg/L,吸附2h时,随投菌量的增加,菌株对Cd2+的吸附率在1.0g/L时趋于稳定,约为94.2 %,单位质量菌体的吸附量随投菌量的增加而逐渐降低.当加入 NP后,吸附率随投菌量的增多呈缓慢增加的趋势,NP的不同浓度对菌体的 Cd2+吸附效果影响不大.相比对照组,NP-Cd共存体系的菌体吸附能力降低.

因此,无NP体系中,吸附率稳定时,单位质量菌株的吸附量随菌浓度的增加而降低,很可能是菌量增加,Cd2+的吸附点位充足,Cd2+浓度与菌体浓度的比值变小,从而减少了单位质量菌株对Cd2+的吸附量.NP的加入,会使一部分菌体表面的吸附点位被占据[23],或者抑制一部分菌体的正常生理代谢甚至使其死亡,而死亡的菌株也能吸附Cd2+,同时也可能存在菌体表面变褶皱,吸附点位增多的情况.但由于投加的菌量多,活菌数量远大于死亡菌株的数量,且死亡菌株中也有部分菌的细胞结构被破坏,不能进行正常的表面吸附,同时,菌量增多会促使Cd2+的释放能力增强,故综合考虑吸附率和吸附量相比于对照组均是下降的.

图3 投菌量与NP浓度对X菌的Cd2+吸附率(柱状图)及单位质量X菌的Cd2+吸附量(折线图)的影响Fig.3 Effect of bacterial concentration and NP concentration on the biosorption rate of Cd2+by bacteria X (histogram) and on Cd2+uptake capacity by unit mass of bacteria X (line chart)

2.4 pH与NP浓度对菌体吸附Cd2+的影响

pH对重金属离子的化学性质、离子间的相互作用及细胞表面基团活性都存在明显影响.图4所示为pH与NP浓度对菌体吸附Cd2+的影响.结果表明,若体系中无NP,随pH的逐渐增大,吸附能力先上升后趋于平稳.加入NP后,不同浓度NP对Cd2+吸附效果影响差异不大.添加NP的体系与对照组相比,在pH为5.0时出现较大差异,pH为7.0～8.0时,NP的抑制差异不明显,吸附率可达89.9 %,因此将pH=7.0作为后续实验的最适pH.

pH对细胞表面的官能团变化以及对金属自身性质的影响,直接或间接导致菌体细胞吸附金属离子的能力的不同[24].综上,X菌在中性左右条件下有良好的Cd2+吸附效果.pH低于5时,无NP体系中Cd2+的吸附效果变化较大,可能是pH过低,水合氢离子会与Cd2+竞争吸附位点,因此质子化程度越大,菌体越难吸附Cd2+;同时,pH也可影响微生物的生长代谢,易导致膜电位的改变,使微

生物难以适应新环境而影响吸附 Cd的效果[20]. pH在5.0～7.0时,在同一pH条件下,与对照组相比,NP的存在均使 Cd2+的吸附率大大降低,可能是因为NP与Cd2+存在吸附点位的竞争,NP的吸收占据优势,导致菌体难以吸附 Cd2+.而 pH＞7.0后,无论NP存在与否,不同pH间的Cd2+吸附效果均无明显差异,说明菌体表面的吸附位点已达到饱和,NP对Cd2+的吸附影响不大.

图4 pH和NP浓度对X菌的Cd2+吸附率的影响Fig.4 Effect of pH and NP concentration on the biosorption rate of Cd2+by bacteria X

2.5 活菌与失活菌吸附Cd2+的差异

为保障菌体内部结构稳定,最大化地保留其表面的有效官能团,阻止其生长代谢,研究活菌与失活菌对 Cd2+的吸附差异,本文实验采用戊二醛对菌体进行固定,结果如图5.由图5可知,无论NP存在与否,失活菌体的吸附效果明显优于活菌,这一结果与白洁琼等[25]的研究结果一致,说明X菌的吸附机理与菌体活性有关.无 NP体系中,1.0g/L失活菌对Cd2+的吸附效果优于相同量的活菌吸附效果.比较不同NP浓度,菌体的Cd2+吸附效果均无明显差异;但与对照组相比,活菌的吸附能力大幅度下降,而失活菌的吸附能力变化微小.

分析吸附率的变化趋势得出,活菌对 Cd2+的吸附可能是表面吸附/脱附与主动运输/释放相结合,进而将积累在表面和胞内的超负荷 Cd2+排出细胞,同时,菌体自身释放的阳离子与Cd2+形成竞争关系会抑制其对 Cd2+的吸附.固定后的菌体已经失去活性,对Cd2+的吸附以表面吸附为主,不存在对Cd2+的主动运输/释放.同时,体系中存在NP时,NP的毒性会影响活菌的正常生长代谢,或是NP与 Cd2+对有效吸附位点的竞争,导致活菌吸附能力下降.而失活菌不能进行生长代谢,故 NP浓度对其无明显影响[23].

图5 生理条件与NP浓度对X菌的Cd2+吸附率的影响Fig.5 Effect of physiological conditions and NP concentration on the biosorption rate of Cd2+by bacteria X

2.6 不同NP浓度对菌体吸附Cd2+的影响

在最佳吸附时间、Cd2+初始浓度、投菌量及pH的条件下,改变NP浓度,获得菌体对Cd2+的吸附效果(图6).由图6可知,随着NP浓度的增加,X菌对 Cd2+的吸附效率降低.无 NP,吸附 2h时, 1.0g/L菌体对 1.0mg/L Cd2+的吸附率达 89.8%,表明X菌能很好的吸附Cd2+.当加入NP时,NP浓度的升高使菌株吸附 Cd2+的能力总体呈缓慢下降趋势.当NP浓度为0.1mg/L时,菌体的吸附率较对照组下降了 25.7%;而 NP浓度在 0.1～10mg/L范围内,菌体吸附率下降非常缓慢;当浓度升至50mg/L时,吸附率迅速下降到8.6%,菌株基本丧失了吸附能力.

通过以上分析,NP对菌体吸附 Cd2+有一定的影响,低浓度NP影响较小,高浓度NP影响较大.可能原因是低浓度NP能为Cd的去除提供碳源和能源,故有较好的吸附效果[21].随着NP浓度增高,NP-Cd复合破坏了菌体细胞膜的通透性,影响其生长代谢机制,对菌体的毒害作用逐步增强;

此外,由于菌体对NP的吸收位点与对Cd2+的吸附位点相同,在高浓度NP条件下,NP更易于接触有效位点,且易于达到吸附饱和,从而与Cd2+形成显著竞争,这都会导致菌体难以吸附Cd2+.

图6 NP浓度对X菌的Cd2+吸附率的影响Fig.6 Effect of NP concentration on the biosorption rate of Cd2+by bacteria X

2.7 红外光谱分析

鉴于以上,即在NP存在时,X菌的Cd2+吸附基本为表面吸附,进一步考察吸附前后菌体表面官能团的变化,结果如图7所示.可以看出,菌体在不同Cd2+和NP浓度下吸附前后的峰数目和峰形变化明显,部分吸收峰发生偏移现象,说明X菌在处理单一Cd2+及Cd2+-NP复合污染时有表面基团参与,主要在 2800 ～ 3500cm-1和 500 ～1700cm-1范围内出现吸收带[25].3000 ～ 3400cm-1处的谱锋是 O—H 的伸展运动[26],2800 ～3000cm-1为 CH2的不对称伸缩运动[27],1400 ～1650cm-1处的谱锋来自典型的酰胺Ⅰ带(C=O的伸缩振动)、酰胺Ⅱ带(N—H的弯曲振动和C—N的伸缩振动)和酰胺Ⅲ带(C—N的伸缩振动),1200 ～ 1400cm-1处的峰形变化与P—O和C—S的叠加振动和胺基化合物中C—N的伸缩振动等有关,低于 650cm-1是金属离子与氧缔合形成的谱峰.

3000 ～ 3400cm-1范围内随着单一及复合污染物的加入,峰形变圆钝,证明菌体表面存在羟基,并且可能参与 Cd2+的吸附[28].同时,2800 ～ 3000cm-1处的峰形变化可能是由于相邻基团羟基的变化所致,也可发现,高浓度NP存在时峰形变尖锐,说明高浓度NP对官能团影响较大.1400～ 1650cm-1处的谱峰向低波数处微小偏移,说明Cd2+与酰胺发生络合,降低其活性,且a～d的峰形由圆钝变尖锐,说明高浓度NP影响酰胺作用.

图7 X菌处理单一Cd2+及Cd2+-NP复合污染后的红外光谱图Fig.7 FTIR spectra of bacteria X before and after the treatment of single Cd2+and combined Cd2+-NP

3 结论

3.1 在NP与Cd2+共存时,通过对物化因子的控制,利用一株铜绿假单胞菌X吸附Cd2+,在吸附时间为2h,投菌量为1.0g/L,pH为7.0时,Cd吸附条件最适宜;初始Cd2+浓度为1.0mg/L时,吸附率可达到90.0 %左右.

3.2 NP存在时,X菌对Cd2+的吸附与菌体活性有关,失活菌的吸附效果更好,但不同NP浓度对吸附基本无影响,这也说明活菌对 Cd2+的吸附不仅与细菌表面吸附/脱附有关,还与主动释放/主动运输等过程有关.

3.3 不同NP浓度对菌体吸附Cd2+的影响不同,低浓度NP影响较小,高浓度NP影响较大,且高浓度NP能影响官能团反应,从而影响Cd2+的吸附.

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Biosorption of cadmium in nonylphenol-cadmium compound pollution by Pseudomonas aeruginosa X.

WEI Lan1, ZHU Yue-fang2, SHI Guang-yu1, HE Li3, CHEN Yu1, SHI Wei-lin1*(1.College of Environmental Science and Engineering, University of Science and Technology of Suzhou, Suzhou 215009, China；2. Environmental Monitoring Center of Suzhou, Suzhou 215004, China；3.College of Renewable Energy Technology, North China Electric Power University, Beijing 102206, China). China Environmental Science, 2016,36(11)：3495～3501

Effects of nonylphenol (NP) on the adsorption of cadmium by Pseudomonas aeruginosa X, which is screened from cadmium (Cd) contaminated site was investigated. Experiments were undertaken to study the biosorption of cadmium at NP concentrations of 0、1.0、10.0mg/L respectively. It was revealed that the optimal concentration of Pseudomonas aeruginosa X and pH were 1.0g/L and 7.0respectively with initial Cd2+concentration of 1.0mg/L and hybrid with NP. With two hours absorbing, the biosorption rate was about 90 %. The results of biosorption by devitalized bacteria and live bacteria indicated that the adsorption ability of devitalized bacteria was better than that of live bacteria. By considering the different concentrations of NP as variables, it was found that the lower concentration of NP has little suppressing effect on the adsorption of Cd2+. But the suppressing effect was significant at higher concentrations of NP. FTIR spectra of bacteria X treating Cd2+and compound of Cd2+-NP separately indicated that the functional groups of hydroxyl group and amido were involved in the adsorption reaction. Moreover, it indicates that high concentration of NP has a greater impact on the activity of cell surface groups. Thus, high concentration of NP affects the adsorption of Cd2+.

NP；Cd；Pseudomonas aeruginosa X；biosorption；surface groups

X17

A

1000-6923(2016)11-3495-07

魏 蓝(1993-),女,吉林长春人,苏州科技大学硕士研究生,主要从事土壤重金属污染的修复研究.

2016-03-20

国家自然科学基金项目(31570515);江苏高校水处理技术与材料协同创新项目;苏州市科技支撑计划项目(SS201421, SS201523);苏州市环保科技项目(2015-3);江苏省自然科学基金青年基金(BK20150287)

* 责任作者, 教授, weilin-shi@163.com