不同猪种初乳外核体中免疫相关miRNA的鉴定

顾以韧，李智，梁艳，杨雪梅，陶璇，钟志君，陈晓晖，吕学斌

（1.四川省畜牧科学研究院，四川成都610066；2.泸县畜牧局，四川泸州646100）

不同猪种初乳外核体中免疫相关miRNA的鉴定

顾以韧1，李智2，梁艳1，杨雪梅1，陶璇1，钟志君1，陈晓晖1，吕学斌1

（1.四川省畜牧科学研究院，四川成都610066；2.泸县畜牧局，四川泸州646100）

母乳是婴儿最重要的食物来源，对婴儿的健康发育特别是后天免疫的形成有着至关重要的作用，乳质量形成的分子基础已成为当今生物学科领域研究的热点之一。试验采用第2代高通量测序技术（Solexa测序）对大约克夏猪和梅山猪初乳外核体中miRNA进行了鉴定，结果发现，免疫相关的miRNA在初乳中呈现富集现象，且梅山猪初乳外核体中的数量极显著高于大约克夏猪（P＜0.01），而在大约克夏猪个体间差异不显著，说明梅山猪对疾病的抵抗力高于大约克夏猪。此试验可为深入研究母乳在婴儿免疫系统发育过程中的基本功能提供基础数据。

猪；初乳；外核体；miRNA

母乳有初乳和常乳之分，初乳比常乳具有更高的营养价值，它传递了被动免疫保护以及母源的代谢调节信号，对新生后代早期的存活和生长发育起着重要的作用[1]。畜牧业生产中，吃不到母乳的幼畜很难成活，而吃不足母乳或吃不到初乳者抗病力弱，更易患病。目前，对影响乳质量的常规成分已经有了较为系统和深入的研究，但在母乳提高机体免疫能力、增强对疾病抵抗能力以及在幼儿消化系统中存在抗性的分子机理的研究还远不够系统和深入，且主要集中关注DNA和mRNA水平的蛋白编码基因。miRNA是一类内源性的、长度约为22个核苷酸的参与基因转录后水平调控的非编码小分子RNA，它们广泛存在于多种真核生物体中，通过与靶mRNA的3'UTR互补结合，可降解该mRNA或抑制其翻译，其在基因表达调控、生物个体发育、代谢、疾病发生和免疫调控等生理过程中均发挥着重要的作用[2-3]。然而，乳成分十分复杂，并非乳中所有的miRNA在进入新生儿消化系统后均能被消化吸收。研究认为乳中的miRNA可分为两部分：一部分为游离于乳汁中的，没有任何保护的裸露的miRNA；另一部分是被称作外核体（Exosome）包被的miRNA。Exosome是一类直径约30～100 nm广泛存在各种体液中的小囊泡体，可以保护其中包被的miRNA、mRNA和蛋白质，还能参与细胞之间信息的传递和物质的交换，甚至在植物性食品和人体之间进行交流[4-6]。当母乳进入新生儿的胃内以后，那些裸露于乳汁中的、没有外核体保护的miRNA将被胃内极酸的微环境迅速降解，而不能被新生儿的消化系统吸收利用，只有那些被外核体包被的miRNA才能在胃内极酸环境下避免被降解，最终被新生儿消化系统吸收，从而对新生儿免疫系统的完善、保持机体正常发育起重要调控作用。故研究母乳外核体中的miRNA比仅笼统的研究全乳中miRNA更能准确反映母乳是如何调控新生儿免疫系统发育的。采用Solexa测序技术对中外不同猪种初乳外核体中miRNA进行了鉴定，并筛选出与免疫功能密切相关的miRNA，有助于探明不同猪种初乳在调控仔猪机体免疫方面存在明显差异的分子机制，并为深入研究乳质量形成的分子基础提供必要的基础信息。

1 材料与方法

1.1 试验材料及样本采集

选取健康状况良好的3头经产大约克夏母猪和1头梅山母猪，在分娩时立刻采集试验所需的母猪乳样本，每头猪采集2份母乳样本（每份3～5 mL），并将其保存在液氮中用于后续试验。试验时间为2014年6—12月，试验地点为四川省畜牧科学研究院种猪科研基地。

1.2 外核体沉淀及RNA提取

首先吸取母乳1.5 mL 2 000 g/min离心10 min去除乳中的脂肪球，上清液再经过12 000 g/min离心30 min去除细胞碎屑等杂质，然后按照2∶1的比例加入ExoQuick Exosome Precipitation Solution（SBI,CA, USA）4℃孵育12 h后进行1 500 g/min离心30 min获得Exosome颗粒沉淀，用250 μL左右的RNAfree水将Exosome沉淀溶解后再用TRIzol®LS Reagent（美国Invitrogen公司）按照说明书从Exosome中提取高质量的RNA。提取得到的该RNA样品经过AgilentBioanalyzer 2100检测后用于下游试验。

1.3 miRNA的高通量测序及免疫密切相关的miRNA的筛选

采用美国Illumina公司开发的高通量测序技术对通过上述方法提取得到的母乳RNA样品进行miRNA深度测序，测序结果经过数据初处理和生物信息学分析后鉴定出猪乳外核体中的miRNA，该部分由美国LC公司完成。对鉴定出的miRNA结合Pathway Central database（SABiosciences,MD,USA）（http://www.sabiosciences.com/mirna_pcr_array.php）数据库中对miRNA功能的注释，在猪乳外核体中筛选与免疫功能密切相关（与数据库中的Immunopathology,InflammatoryResponseandAutoimmunity,T-Cell&BCell Activation 3部分功能相对应）的miRNA。

1.4 统计方法

试验结果采用Sigmaplot12.0的x2-test程序进行统计分析。

2 结果与讨论

由图1可知，在3头大约克夏猪母乳外核体中共检测到的miRNA数量分别为147、153和159种，其中免疫相关的miRNA（SABiosciences database）数量分别为52、56和56条，分别占鉴定的miRNA总数的35.37%、36.60%和35.22%。梅山猪母乳外核体中共检测到miRNA 146种，其中免疫相关的miRNA数量为81种，占被鉴定的miRNA总数55.48%。以上结果说明，无论在大约克夏猪还是梅山猪中，免疫相关的miRNA在其初乳外核体中均存在明显的富集现象，这也与我们之前对不同泌乳期猪乳外核体中miRNA的鉴定结果一致[7]。这些免疫相关的miRNA在初乳中由于受到外核体的保护而使其能够在外界极端恶劣条件下不被降解，其调控功能主要涉及到免疫病理、炎症反应和自身免疫、T细胞和B细胞活性等方面，因此初生仔猪及时吮吸初乳可促进自身机体免疫系统的快速建立并迅速增强其对疾病的抵抗能力。显著性统计结果显示，免疫相关的miRNA在梅山猪初乳外核体中的数量极显著高于大约克夏猪（P＜0.01），而在大约克夏猪个体间差异不显著，这说明同等情况下梅山猪仔猪可能比引进猪种—大约克夏猪更早建立起完善的自身免疫系统，其对疾病的抵抗力也高于大约克夏猪。我们推测猪乳中的这些与免疫相关的miRNA是通过仔猪消化道被吸收，进而对幼畜的免疫系统发挥调控功能的，这也与我国梅山猪的抗逆性优于国外猪种大约克夏猪的种质特性相一致。本研究不仅可为乳的研究提供新的思路，而且可为猪的抗病育种提供可靠的基础数据。

图1 大约克夏猪和梅山猪母乳外核体中免疫相关miRNA

[1]Paramasivam K,Michie C,Opara E,et al.Human breast milk immunology:a review[J].Int J Fertil Womens Med,2006,51:208-217.

[2]Bartel D P.MicroRNAs:target recognition and regulatory functions[J].Cell,2009,136:215-233.

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[7]Gu Y,Li M,Wang T,et al.Lactation-related microRNA expression profiles of porcine breast milk exosomes[J].PloS ONE, 2012,7(8):e43691.

（编辑：富春妮）

Identification of Immune-Related MicroRNA in Porcine Colostrum Exosomes of Yorkshire and Meishan Pigs

GU Yiren1,LI Zhi2,LIANG Yan1,YANG Xuemei1,TAO Xuan1,ZHONG Zhijun1,CHEN Xiaohui1,LV Xuebin1
(1.Sichuan Aniamal Science Academy,Chengdu 610066,China; 2.Lu County Animal Husbandry Bureau,Luzhou 646100,China)

Breast milk,the primary source of nutrition for newborns,plays important roles in infant's growth and is crucial for the development of the post-natal immune system.It is of great interest to decipher the molecular mechanism of breast milk quality which is beneficial for immune diseases researches.Here,we analyzed the immune related miRNA in porcine colostrum by a deep sequencing and found that immune related miRNAs are present and enriched in breast milk exosomes.Notably,these exosomal immune related miRNAs are present in higher numbers in the colostrums of Meishan pigs than the Yorkshires pigs(P＜0.01).These observations are a prelude to in-depth investigations of the essential roles of breast milk in the development of the infant's immune system.

pig;colostrum;exosome;miRNA

S828

A

1002-1957(2016)02-0060-02

2016-03-10

国家自然科学基金（31301942）；四川省畜牧科学研究院基本科研业务费（SASA2014A08）；国家生猪产业技术体系—综合试验站（CARS-36）

顾以韧（1980-），男，江苏响水人，副研究员，博士，研究方向为动物遗传育种.E-mail:guyiren1128@163.com

吕学斌（1965-），男，研究员，博士，研究方向为猪的遗传育种.E-mail:lvxuebin@21cn.com