猪肺炎支原体和猪鼻支原体在屠宰猪呼吸道与血液中的分布

王贵平，李君佩，王亚楠，罗广，胡仕凤，李晓云

（湖南农业大学动物医学院，湖南长沙410128）

猪肺炎支原体和猪鼻支原体在屠宰猪呼吸道与血液中的分布

王贵平，李君佩，王亚楠，罗广，胡仕凤，李晓云

（湖南农业大学动物医学院，湖南长沙410128）

用PCR方法对从湖南省长沙市515头屠宰猪收集的1 204份样品（120份猪鼻拭子、254份猪支气管拭子、515份猪支气管肺泡灌洗液和235份猪肺、80份血液）进行了猪肺炎支原体和猪鼻支原体检测，并对部分PCR产物进行序列分析。结果发现，猪肺炎支原体在猪支气管灌洗液中检出率最高（23.3%，120/515），猪鼻拭子和血液中检出率最低（0）；猪鼻支原体在猪鼻拭子中检出率最高（24.3%，125/515），在猪支气管拭子中检出率最低（2.5%，3/120）。序列分析表明：试验的PCR产物与国内已出版的相关序列有97%～100%的同源性。试验探明了猪肺炎支原体和猪鼻支原体在猪呼吸道与血液中的分布情况，为这两种支原体的分离鉴定提供了依据。

猪肺炎支原体；猪鼻支原体；猪呼吸道；分布

猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp）是猪喘气病的主要病原。Mhp黏附于猪呼吸道纤毛上皮细胞，使纤毛的清除功能受损，继而引起持续的炎症反应及高传染性的慢性呼吸道疾病，对世界范围的养猪生产造成重大的经济损失[1-2]。猪喘气病之所以长期存在而难以防控，原因之一是Mhp在猪体内一般呈慢性或隐性感染而临床症状不明显，猪长期带菌成为传染源[3-4]。猪肺炎支原体通常被认为是该病的病原，但是最新研究表明猪鼻支原体（Mycoplasma hyorhinis,Mhr）也能引起典型的猪支原体肺炎病变[5]。Mhp和Mhr常从没有感染其他微生物的猪肺中进行分离鉴定。但是随着养猪业规模化发展，符合要求的猪肺日益难以获得。本试验探明了Mhp和Mhr在猪体内的分布情况，为探索新的分离鉴定方法（如从灌洗液中分离Mhp）奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 样品

2015年1月，从湖南省某屠宰场采集1 204份猪样品。样品采集收送湖南农业大学动物医学院检测。猪鼻拭子和猪支气管拭子：用无菌的棉签分别在屠宰猪鼻孔和气管管壁中来回涂擦3次，然后在含有1.5 mL KM2液体培养基的EP管中剧烈搅动，弃去棉签；猪支气管肺泡灌洗液：将50 mL无菌的PBS（pH 7.8）灌入猪支气管中，来回颠倒3次后收集液体（约10～30 mL）。猪肺样品：在猪肺尖叶切割一小块肺脏；猪血液样品：在猪屠宰放血时用无菌离心管收集20～30 mL。

1.2 试剂

KM2液体培养基：购自江苏省农业科学院畜牧兽医研究所。PCR引物：根据相关文献[5]，由上海生物工程技术有限公司合成（表1）。

表1 本试验所用的引物

1.3 PCR模板制备和PCR扩增

按相关文献[6]制备和进行。

1.4 序列分析和呈送GenBank

将2份Mhp 16S rRNA基因扩增的产物和1份Mhr P37基因扩增的产物送华大基因武汉中心测序，并用BLAST软件（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi PAGETYPE）和国内外已经发表的序列进行同源性比较。将测得的序列用Bankit方法呈送至NCBI基因库。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增结果

从阳性样品中分别扩增出大小约649 bp和346 bp特异性条带（图1），与预期结果相符。

图1 PCR鉴定结果

2.2 测序与同源性分析

测序结果已经成功呈送至GenBank，序列号分别是GU569848、GU569849（Mhp 16S rRNA基因）和GU722587（Mhr P37基因）。同源性分析表明与国内外相关序列有97%～100%的同源性。

2.3 Mhp在猪呼吸道和血液中的分布

从表2可以看出，Mhp总阳性率是24.6%（127/ 515）。冬季阳性率最高（79.2%，95/120），夏季最低（0）。在不同的样品中，支气管肺泡灌洗液检出率最高（23.3%，120/515），鼻拭子和血液检出率最低（0）。

2.4 Mhr在猪呼吸道和血液中的分布

从表3可以看出，Mhr总阳性率是25.8%（133/ 515）。冬季阳性率最高（82.5%，99/120），秋季最低（0）。在不同的样品中，鼻拭子检出率最高（24.3%，125/515），支气管拭子检出率最低（2.5%，3/120）。

表2 猪肺炎支原体在猪呼道和血液中的检出率

表3 猪鼻支原体在猪呼吸道和血液中的检出率

3 讨论

（1）本试验首次就Mhp和Mhr在屠宰猪呼吸道与血液中的分布进行了探究。猪肺炎支原体在猪上呼吸道（鼻拭子）检出率为0。随着呼吸道深入，Mhp的检出率逐渐升高（支气管拭子，7.1%），在支气管处检出率升至最高（支气管肺泡灌洗液，23.3%），然后逐步降低（肺，18.7%）。Mhr在上呼吸道检出率最高（鼻拭子，24.3%），而在中呼吸道逐渐降低（支气管拭子，2.5%），然后逐步升高（支气管肺泡灌洗液，6.7%；肺，17.8%）。

（2）从季节分布看Mhp和Mhr在冬季的检出率明显高出其他季节，这和猪喘气病的流行病学是一致的。建议从冬季的鼻拭子中检测和分离Mhr，从冬季的支气管肺泡灌洗液和猪肺中检测和分离Mhp。

（3）Mhr是猪喘气病最常见的继发菌，可以伴发猪的多发性浆膜炎和关节炎。本试验首次从血液中检出了Mhr，为证实Mhr从血液中循环到关节提供了坚实的依据。

[1]李彦伟，刘茂军，武昱孜，等.猪肺炎支原体致病机理研究进展[J].动物医学进展，2013，34（8）：84-88.

[2]Moitinho-Silva L,Heineck B L,Reolon L A,et al.Mycoplasma hyopneumoniae typeⅠsignal peptidase：expression and evaluation of its diagnosetic potential[J].Vet Microbiol,2012,154(3/4)：282-291.

[3]Vangroenweghe F A,Labarque G G,Piepers S,et al.Mycoplasma hyopneumoniae infections in peri-weaned and postweaned pigs in belgium and the netherlands：prevalence and associations with climatic conditions[J].Vet J,2015,205(1)：93-97.

[4]Caron J,Ouardani M,Dea S.Diagnosis and differentiation of Mycoplasma hyopneumoniae and Mycoplasma hyorhinis Infections in pigs by PCR amplification of the p36 and p46 genes[J].J Clin Microbiol,2000,38(4)：1390-1396.

[5]Lin J H,Chen S P,Yeh K S,et al.Mycoplasma hyorhinis in Taiwan：diagnosis and isolation of swine pneumonia pathogen[J].Vet Microbiol,2006,115(1-3)：111-116.

[6]王贵平，胡仕凤，邓治邦.猪胸膜肺炎放线杆菌和猪肺炎支原体混合感染的诊治[J].养猪，2009（6）：57-59.

（编辑：郭玉翠）

S858.28

A

1002-1957(2016)01-0119-02

2015-12-31

湖南省教育厅优秀青年基金资助科研项目（13B050）

王贵平（1973-），男，湖北咸宁人，副教授，博士，研究方向为猪细菌性传染病.E-mail：wanggp003@163.com