天津某猪场沙门氏菌的分离鉴定

杨晓伟，蒙晓雷，郭恋，王健春

（1.天津市兽药饲料监察所，天津北辰300402；2.天津市动物疫病预防控制中心，天津北辰300402）

天津某猪场沙门氏菌的分离鉴定

杨晓伟1，蒙晓雷2，郭恋2，王健春2

（1.天津市兽药饲料监察所，天津北辰300402；2.天津市动物疫病预防控制中心，天津北辰300402）

利用亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）、沙门氏-志贺氏属琼脂培养基（SS）、科玛嘉（ECC）沙门氏菌显色培养基和分子生物学方法对猪场疑似沙门氏菌感染的仔猪腹泻粪样进行沙门氏菌的分离鉴定。根据SS选择性培养基上菌落形态选取疑似沙门氏菌菌落进行革兰氏染色，确定是否符合沙门氏菌的革兰氏染色形态，并将疑似菌落涂布于科玛嘉（ECC）沙门氏菌显色培养基，当长出紫色菌落时可初步确定为沙门氏菌，最后进行PCR鉴定。将分离出的阳性沙门氏菌进行玻片凝集试验鉴定血清型。经鉴定，分离株的血清型主要有鼠伤寒沙门氏菌与德尔卑沙门氏菌两种。药敏试验结果表明，沙门氏菌对青霉素类的氨苄西林、阿莫西林及第1代喹诺酮类药物萘啶酸表现出明显的耐药性，对磷霉素、头孢类药物敏感。

沙门氏菌；分离鉴定；血清型；药敏试验

沙门氏菌属（Salmonella）属致病能力强的革兰氏阴性短杆菌，无芽孢，绝大部分无荚膜，主要寄生于人等动物肠道内，其生化特性和抗原结构相似，兼性厌氧，在三糖铁琼脂上培养常产生硫化氢（H2S）。根据新近的沙门氏菌的分类方案，该属细菌包括邦戈尔沙门氏菌（S.bongori）与肠道沙门氏菌（S.enterica，或称其为猪霍乱沙门氏菌S.choleraesuis）两个种。而肠道沙门氏菌又可以再分成6个亚种：肠道亚种（enterica）、豪顿亚种（houtenae）、亚利桑那亚种（arizonae）、萨拉姆亚种（salamae）、英迪加亚种（indica）和双相亚利桑那亚种（diarizonae）。这些种和亚种均属于对应的DNA同源群。沙门氏菌有O、H、K和纤毛4种抗原，其中O和H是主要抗原，沙门氏菌属根据不同的H（鞭毛）抗原、O（菌体）抗原和Vi（荚膜）抗原可以分成多种血清型。至今，沙门氏菌已发现有A～Z与O51～O67共51个O群，共58种O抗原和63种H抗原[1]。

本病一年四季都可发生，一般呈散发性，如果有恶劣因素的严重刺激，也能呈地方性流行。传染源主要是发病者和带菌者。有两种传播途径：一种是由于生病畜禽及带菌者排出的病原体污染了土壤、水源或饲料，健康畜禽食用了被病原菌污染的饲料而感染发病；另一种是该菌平时即已存在于健康畜禽体内但不表现临床症状，只有当不良外界因素导致动物体的抵抗力下降，病原体大量增殖，毒力也得到加强而导致畜禽疾病。另据资料表明，健康畜禽的带菌现象现已非常普遍，病原菌往往潜藏于淋巴组织、胆囊与消化道内，可连续经过多只易感畜禽，毒力有时即可增强而扩大感染[2]。

猪感染沙门氏菌后出现急性和慢性两种类型。急性型在发病初期体温升至41℃，病猪食欲不振，精神萎靡，初便秘后腹泻，排出淡黄色恶臭粪便，在鼻端、耳、颈、腹及四肢内侧出现紫色斑，病猪最后会呼吸困难，衰竭而亡，病期3～5 d。慢性型最为常见，表现为下痢，粪便呈粥状或水样，灰白、黄绿等颜色，有时混有血液；严重时肛门失禁；有的病猪发生肺炎，有的病猪出现湿疹样变化。由于持续下痢，病猪消瘦、行走摇晃，最后衰竭死亡，病期达半个月以上，有的甚至2个月才死亡[3]。

通过对疑似沙门氏菌感染的仔猪腹泻粪样进行培养和分离鉴定，革兰氏染色镜检，PCR检测和血清学诊断，确定病原菌为沙门氏菌，利用药敏试验分析各分离株对抗生素的敏感性，以了解临床分离株的培养特性、耐药性、致病机制和沙门氏菌病的症状特点。

1 材料与方法

1.1 试验时间与地点

试验于2015年7—9月在天津市动物疫病预防控制中心实验室进行。

1.2 仪器设备

超声波清洗器、多管架自动平衡离心机、立式高压蒸汽灭菌器、生物显微镜、PCR仪、电泳仪等。

1.3 试剂

沙门氏菌属诊断血清试剂盒、药敏纸片、亚硒酸盐胱氨酸增菌培养液（SC）、SS琼脂、LB肉汤培养基、革兰氏染色液、PCR混合体系等。

1.4 试验对象

疑似沙门氏菌感染的仔猪腹泻粪样来自于天津某家猪场中6栋猪舍。

鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）标准株购自于中国工业微生物菌种保藏中心（China Center of Industrial Culture Collection,CICC）；CICC编号：22956（微生物菌种应保存于低温、干燥和清洁的地方，室温时间过长会导致菌种衰退）。

1.5 试验方法

1.5.1 沙门氏菌的分离与纯化

（1）取疑似沙门氏菌感染的仔猪腹泻粪样2 g（粪样多时最好多取）于离心管中，随后加入14 mL SC增菌液，置于恒温培养箱37℃，培养24 h。

（2）用接种环蘸取增菌液划线接种于SS培养基上，37℃培养24 h。

（3）用接种环蘸取上述可疑菌落于含5 mL LB汤培养基的离心管中，置于恒温培养箱37℃，培养24 h。

（4）同样选取上述SS培养基上沙门氏菌可疑菌落涂布于科玛嘉（ECC）沙门氏菌选择性培养基，进一步确认是否为沙门氏菌。当科玛嘉沙门氏菌选择性培养基上生长紫色菌落时即可确定上述疑似菌落为沙门氏菌。

（5）挑取科玛嘉（ECC）培养基上生长的紫色菌落进行纯化培养。

1.5.2 革兰氏染色镜检依据常规染色法进行染色镜检[4]。

1.5.3 PCR检测

（1）PCR扩增使用通用引物invA，引物序列长度为605 bp，上游引物F序列：invAF 5′-AAACCTA AAACCAGCAAAGG-3′，下游引物R序列：invAR 5′-TGTACCGTGGCATGTCTGAG-3′。

（2）PCR反应体系（使用博迈德反应试剂）：2× Master Mix 12.5 μL；ddH2O 8.5 μL；模板2 μL；上游引物1 μL；下游引物1 μL。

（3）PCR反应循环设置：94℃3 min；94℃30 s；55℃30 s；72℃1 min；72℃5 min；30个循环。

（4）取PCR产物5 μL放入有Goldvlew的2%琼脂糖凝胶，并同时加PCR Marker和阴阳性对照，140 V，跑胶30 min。

（5）将跑好的琼脂糖凝胶放于凝胶成像系统记录结果。

1.5.4 沙门氏菌的血清型鉴定根据沙门氏菌血清学鉴定国家标准（GB 4789.4—2010）进行平板凝集试验，鉴定沙门氏菌血清型的O抗原与H抗原，划分血清型。

2 结果与分析

2.1 分离鉴定及PCR检测结果

分离得到的6株菌，编号分别为1、2、3、4、5、6。革兰氏染色镜检结果可见红色的革兰氏阴性、大小均匀、无芽孢和荚膜、多散在排列的两端钝圆短杆状菌。PCR检测结果见图1。

2.2 血清型鉴定

1、2、3、4、5号菌株血清型为1，4，[5]，12:i:1，2，经查阅资料可知其为鼠伤寒沙门氏菌（S.typhimurium）[1]；6号菌株血清型为1，4，[5]，12:f:g:[1，2]，经查阅资料可知其为德尔卑沙门氏菌（S.derby）[1]。

图1 PCR检测结果

2.3 药敏试验结果

由图2—图10可知，6株沙门氏菌对抗生素的敏感程度由高到低依次为磷霉素、头孢哌酮、加替沙星、头孢拉定、卡那霉素、新霉素、萘啶酸、氨苄西林、阿莫西林。

图2 阿莫西林药敏试验结果

图3 氨苄西林药敏试验结果

图4 加替沙星药敏试验结果

图5 卡那霉素药敏试验结果

图6 头孢拉定药敏试验结果

图7 萘啶酸药敏试验结果

图8 新霉素药敏试验结果

图9 磷霉素药敏试验结果

图10 头孢哌酮药敏试验结果

3 讨论

3.1 分离鉴定

在临床导致仔猪副伤寒的沙门氏菌主要有肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、猪伤寒沙门氏菌、猪伤寒沙门氏菌Voldagsen变型、猪霍乱沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌Kunzendorf变型、德尔卑沙门氏菌等。在仔猪腹泻粪样中分离得到了6株菌，其中5株为鼠伤寒沙门氏菌，1株为德尔卑沙门氏菌，佐证了鼠伤寒沙门氏菌的高分离率，德尔卑沙门氏菌较罕见，表明了沙门氏菌所导致的腹泻中鼠伤寒沙门氏菌占较大比重而德尔卑沙门氏菌占的比重少，也说明了沙门氏菌对仔猪有较强致腹泻作用。

3.2 药敏试验

药敏试验结果表明，在猪场中青霉素类的氨苄西林、阿莫西林以及第1代喹诺酮类药物萘啶酸表现出明显的耐药性，这与临床用药有很大关系，青霉素类由于其应用较早，在临床上形成了很多的耐药菌株。喹诺酮类成为青霉素类治疗腹泻的替代品，逐渐进入临床应用，耐药菌株也在增多，对于沙门氏菌病青霉素类、部分喹诺酮类作用已经不大。要根据药敏试验的结果指导临床用药，切不可盲目用药，导致耐药菌谱扩大，并达到以尽可能少的药物达到最佳治疗效果，避免出现无药可医的局面。

4 结论

本试验从仔猪腹泻粪样中分离出鼠伤寒沙门氏菌（S.Typhimurium）与德尔卑沙门氏菌（S.Derby）这两种血清型的沙门氏菌，不仅说明了沙门氏菌是导致仔猪腹泻的重要病原菌，而且鼠伤寒沙门氏菌是其中较常见的病原菌，对于沙门氏菌导致的仔猪腹泻的治疗宜选用像磷霉素、头孢类药物，此类药物目前仍能起到良好的治疗效果，沙门氏菌的侵染途径是先侵入小肠上皮进入血液，引起菌血症甚至败血症，随后随血液侵入其他组织，引起较严重的系统性疾病。

[1]黄嫱，刘卫国，马飞，等.沙门氏菌病的防控[J].畜牧与饲料科学，2010，31（11-12）：163-165.

[2]黄伟，汤德元，杨泽平，等.猪沙门氏菌病的诊断方法及防制研究进展[J].猪业科学，2010（4）：76-77.

[3]王连纯，王楚端，齐志明.养猪与猪病防治[M].第2版.北京：中国农业大学出版社，2003：339-350.

[4]姚火春.兽医微生物学实验指导[M].第2版.北京：中国农业出版社，2002：15-17.

（编辑：富春妮）

Isolation and Identification of Salmonella in a Pig Farm in Tianjin

YNAG Xiaowei1,MENG Xiaolei2,GUO Lian2,WANG Jianchun2
（1.Tianjin Institute of Veterinary Drug and Feed Control,Tianjin 300402,China; 2.Tianjin Center of Animal Disease Prevention and Control,Tianjin 300402,China)

The Salmonella from faeces of the same pig farm that suspectedly had undergone Salmonella infection were isolated and identified by use of selenite cysteineenrichment broth(SC),Salmonella-shigella agar(SS)and molecular biological method.Based on the morphology on SS culture medium,the suspected single colony was picked up and performed the Gram staining to ensure whether it is consistent with the morphology of gram-negative bacteria.In addition,the suspected single colony was inoculated to CHROM agar Salmonella colored medium where Salmonella would grow to purple colonies.Those highly suspected Salmonella colonies would be confirmed by PCR method.The serotype of isolated Salmonella strains were assayed by slide agglutination test.The results showed those positive Salmonella strains mainly contained two serotypes,Salmonella typhimurium and Salmonella derby.Six clinical strains respectively isolated from the pig farm were compared through the drug resistance test. The drug sensitive test indicated that:Salmonella showed obvious resistance to Ampicillin and Amoxicillin of Penicillins,Naphthalene acid of the first generation of Quinolones,but Salmonella is sensitive to Fosfomycin and Cephalosporins.

Salmonella;isolation and identification;serotype;drug sensitive test

S858.282.61+2

A

1002-1957(2016)03-0105-04

2016-04-14

杨晓伟（1982-），男，天津人，兽医师，硕士，主要从事兽药、饲料和动物疫病的监测工作.E-mail:tgmonia@163.com