纳米雄黄对卵巢癌细胞COC1凋亡的影响*

马淑云，高尚风，吴胜军，张少华，陈 蕊，王 莉，徐 锐

(1．西安医学院第一附属医院妇科，西安 710077；2．西安交通大学医学院第一附属医院妇产科，西安 710061；3．西安医学院第一附属医院科研科，西安 710077)

论著·基础研究

纳米雄黄对卵巢癌细胞COC1凋亡的影响*

马淑云1，高尚风2，吴胜军1，张少华1，陈 蕊1，王 莉3，徐 锐3

(1．西安医学院第一附属医院妇科，西安 710077；2．西安交通大学医学院第一附属医院妇产科，西安 710061；3．西安医学院第一附属医院科研科，西安 710077)

目的 探讨纳米雄黄对卵巢癌细胞COC1的凋亡作用。方法 0.6μmol/L浓度的纳米雄黄作用于COC1细胞，于不同时间收集的细胞。倒置显微镜下观察细胞形态，流式细胞仪检测细胞凋亡率，RT-PCR检测细胞中Bax、Bcl-2和Caspase-3的mRNA的表达水平，蛋白免疫印迹法(Western blot)检测细胞中Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白的表达水平。结果 0.6μmol/L浓度的纳米雄黄作用于COC1细胞48h后出现显著的凋亡形态改变；纳米雄黄显著的促进细胞凋亡，并随着纳米雄黄处理COC1细胞时间的延长凋亡率显著性增加(P<0.05)；随着纳米雄黄处理间的延长COC1细胞中的Bax和Caspase-3的mRNA和蛋白表达水平显著增加(P<0.05)，Bcl-2的mRNA和蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。结论 纳米雄黄对COC1细胞有显著的促凋亡作用，其作用机制可能与升高Bax和Caspase-3的表达和降低Bcl-2的表达有关。

纳米雄黄；COC1细胞；Bax；Bcl-2；Caspase-3

目前，因卵巢癌而死亡的女性排在所有女性恶性肿瘤的首位。近年来临床医生对卵巢癌的治疗主要是采用以铂类化疗药物为基础的化疗，但随着卵巢恶性肿瘤细胞对铂类化疗药物出现不同程度的耐药性，使以铂类化疗药物为基础的化疗效果十分不理想[1]。雄黄是我国中医药常用的一种含有砷的化合物，有学者研究表明雄黄对白血病有显著的疗效[2-3]。采用纳米技术处理得到的纳米雄黄相对于雄黄具有溶解性高、毒性降低的特点。然而，关于雄黄抑制卵巢癌恶性肿瘤细胞增殖和促进其凋亡的作用机制尚不清楚。有研究表明Bax、Bcl-2和Caspase-3在组织细胞的增殖和凋亡的过程中起着非常重要的要用[4-5]。因此，本文观察纳米雄黄作用卵巢癌细胞COC1后，观察COC1的凋亡作用和Bax、Bcl-2和Caspas-3表达水平的变化，以探究雄黄抑制卵巢癌恶性肿瘤细胞增殖和促进其凋亡的作用机制，为寻找到有效治疗卵巢癌的新药物提供更充足的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人黏液性卵巢恶性肿瘤细胞株COC1由西安交通大学第一附属医院中心实验室友情提供，COC1细胞采用半铁壁悬浮培养。

1.2 主要试剂及仪器 PRMI-1640培养基(美国Gibco公司)，小牛血清(杭州四季青生物材料工程有限公司)，Bax、Bcl-2和Caspas-3抗体(美国Biowoelde公司)，二抗(美国Rockland公司)，雄黄(西安交通大学第一附属医院血液科友情提供)。精细研磨机(山东龙脉科技公司)，光子相关纳米激光粒度分析仪(济南微纳颗粒仪器公司)，垂直电泳槽(瑞典Hoefer Amersham Biosciences公司)，酶标仪(Bio-TEK公司)，流式细胞仪(美国Becton Dickinson 公司)。

1.3 方法

1.3.1 实验分组及培养 实验共分为平行对照组和纳米雄黄组。平行对照组常规培养，无药物干预；纳米雄黄组常规培养，用纳米雄黄浓度为0.6μmol/l小牛血清培养基培养24、48、72h后收COC1卵巢恶性肿瘤细胞。

1.3.2 纳米雄黄的制备 将西安交通大学第一附属医院血液科提供的雄黄采用精细研磨机进行研磨，研磨之后采用光子相关纳米激光粒度分析仪测定研磨后的雄黄颗粒的粒径分布和尺寸的大小。以研磨后的雄黄颗粒平均粒径小于或等于72.79nm作为研磨合格的标准。将研磨处理好的纳米雄黄用不含有小牛血清的培养基进行搅拌溶解，经原子吸收分光光度计检测浓度为62.4μmol/L，作为储备纳米雄黄液。在使用的过程中用含有10%浓度的小牛血清的培养基稀释配制。

1.3.3 COC1细胞培养和纳米雄黄处理 对COC1卵巢恶性肿瘤细胞采用半贴壁悬浮培养，将COC1细胞在含有10%浓度小牛血清的培养基中培养，用含有10%体积浓度的小牛血清的培养基对纳米雄黄储备液进行稀释以配制工作液，配制的纳米雄黄的工作液浓度为0.6μmol/L。当0.6μmol/L浓度的纳米雄黄与COC1卵巢恶性肿瘤细胞作用24、48和72h后收集COC1卵巢恶性肿瘤细胞。

1.3.4 COC1细胞凋亡及细胞周期分析 使用FITC-Annexin V-PI双染流式细胞术对COC1细胞凋亡进行检测，主要步骤为：收集两株生长周期处于对数期的COC1细胞，将COC1的细胞浓度稀释为1×106个/瓶于50mL的培养瓶中，加入适当量的纳米雄黄溶液，配制成0.6μmol/L浓度的工作液。分别培养24、48、72h，收集COC1细胞。用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次后，参照ITC-Annexin V-PI双染试剂盒上的说明，加入相应的试剂，低温避光30min，加入结合液之后在流式细胞仪中检测COC1细胞的凋亡。

1.3.5 COC1细胞中Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白的表达水平的检测 使用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测COC1细胞中Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表达水平。主要步骤为：收集经过0.6μmol/L浓度纳米雄黄工作液处理了24、48、72h后COC1细胞，使用裂解强度中等的RIPA裂解液对收集的COC1细胞进行裂解以提取COC1细胞的总蛋白，使用BCA对提取的总蛋白进行蛋白定量，加入适量的上样缓冲液，取每孔60～80μg蛋白在10%的分离胶中对总蛋白进行电泳分离，将电泳分离后的Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白转移至醋酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉封闭2h，在1∶1000的Bax、Bcl-2和Caspase-3抗体和1∶400的β-actin 抗体中4℃条件下孵育过夜，PBST洗膜3次，每次10min，在1∶3000的二抗中孵育1h，PBST洗膜3次，每次10min，在目的蛋白出涂布ECL发光试剂，在暗室中曝光，用Autogel 图像分析软件对曝光的条带进行分析，比较目的蛋白和β-actin的灰度值。实验重复3次。

1.3.6 COC1细胞中Bax、Bcl-2和Caspase-3mRNA表达水平的检测 收集不同时间的COC1细胞，以400r/min离心10min，收集离心后的细胞，按照RNA提取试剂的操作说明提取每个时间点的细胞中的RNA，检测提取的RNA水平和纯度；参照RT-PCR操作说明检测各时间点COC1细胞中的Bax、Bcl-2和Caspase-3mRNA表达水平。

2 结 果

2.1 纳米雄黄对卵巢癌细胞COC1凋亡细胞形态的影响 卵巢癌细胞COC1经过0.6μmol/L浓度的纳米雄黄处理24h后，细胞开始出现凋亡形态学的改变。但此时的细胞是圆形，细胞的体积没有出现显著缩小，胞核和胞质的边界还未完全分清，多数的COC1细胞仅能观察到深色的细胞核；处理48h后COC1细胞凋亡阳性的细胞数开始增加，细胞形态呈现为非圆形，体积开始显著的缩小，胞质和胞核的边界分清。而在相同的细胞培养时间内，未被纳米雄黄处理的COC1细胞仍然呈现为半贴壁生长，COC1细胞的体积大，观察不到明显的细胞核形态，细胞核呈现为均匀性的淡染，没有特异性的染色,见图1。

2.2 两组卵巢癌细胞COC1凋亡率比较 纳米雄黄组干预24、4872h的凋亡率显著高于平行对照组干预相同时间的凋亡率(P<0.05)；纳米雄黄组中干预72和48h的凋亡率显著高于干预24h的凋亡率(P<0.05)；纳米雄黄组中干预72h的凋亡率显著高于干预48h的凋亡率(P<0.05),见表1。

表1 两组卵巢癌细胞COC1凋亡率比较(%)

2.3 纳米雄黄对卵巢癌细胞COC1中Bax、Bcl-2和Caspase-3mRNA表达的影响 纳米雄黄组COC1细胞中的Bax mRNA和Caspase-3mRNA表达随着干预时间的延长而显著增加(P<0.05)；COC1细胞中的Bcl-2mRNA表达随着干预时间的延长而显著降低(P<0.05)，见图2。

*:P<0.05，与干预24h比较；#:P<0.05，与干预48h比较

2.4 纳米雄黄对卵巢癌细胞COC1中Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表达的影响 纳米雄黄组COC1细胞中的Bax蛋白和Caspase-3蛋白表达随着干预时间的延长而显著增加(P<0.05)；COC1细胞中的Bcl-2蛋白表达随着干预时间的延长而显著降低(P<0.05)，见图3。

*:P<0.05，与干预24h比较；#:P<0.05，与干预48h比较

3 讨 论

卵巢恶性肿瘤是严重威胁女性生命安全的一种恶性肿瘤，目前已是女性三大恶性肿瘤之一。目前，对卵巢癌的治疗主要是以铂类化疗药物为基础的化疗治疗，这种治疗方法在早期时可以收到显著的临床效果，但随着卵巢恶性肿瘤细胞对这些化疗药物的耐受性增加，敏感性降低，在后期治疗过程中临床效果显著降低，达不到理想的治疗效果。硫化物类的化疗药物患有砷元素，在临床上除了具有解毒杀虫、燥湿祛痰、截疟等作用外，还具有治疗慢性粒细胞性白血病等抗肿瘤的作用[6]。目前大多数的研究发现，雄黄主要对血液系统的恶性肿瘤具有抗肿瘤的作用[7]。雄黄抗肿瘤的主要作用机制主要有以下几点：(1)抑制恶性肿瘤细胞的增殖；(2)促进恶性肿瘤细胞的凋亡；(3)抑制实体肿瘤中的血管新生[8-9]。

本研究发现，纳米雄黄对卵巢癌细胞COC1具有显著的促凋亡作用，COC1细胞在0.6μmol/L浓度的纳米雄黄的作用下细胞形态会发生显著的凋亡变化，并且随着纳米胸花处理时间的延长，细胞凋亡形态的变化更严重。在本研究中的流式细胞仪检测凋亡结果表明0.6μmol/L纳米雄黄对COC1细胞的凋亡具有促进的作用，并且随着纳米雄黄处理COC1细胞时间的延长，COC1细胞的凋亡率会显著增高，这些结果表明纳米雄黄对卵巢癌细胞COC1具有促进凋亡的作用。黄娇娥等[10]研究发现，雄黄对人的肝癌细胞Bel-7402具有促进凋亡的作用。本研究结果和其研究结果表明，纳米雄黄除了对血液系统的恶性肿瘤细胞具有抗肿瘤的作用之外，对包括卵巢癌在内的实体瘤也具有显著的抗肿瘤的作用，可以探索雄黄治疗包括卵巢癌在内的实体瘤的治疗。

随着对抗肿瘤药物机制研究的深入，医学界发现多数的抗肿瘤药物主要是通过调节促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白水平的变化来实现抗肿瘤的作用[11-12]。Bcl-2是机体中重要的抑制凋亡的基因，通过编码相应的蛋白来抑制细胞色素C从细胞中线粒体内释放达到抗凋亡的作用[13]。Bax是机体中重要的促凋亡基因，通过编码相应的蛋白达到促进恶性细胞凋亡的作用[14]。但Bcl-2编码的凋亡抑制蛋白增多会与Bax结合抑制恶性肿瘤细胞的凋亡。当Bcl-2/Bax比值发生变化时会调节凋亡蛋白Caspase-3的表达，进而决定促进肿瘤细胞凋亡或抑制肿瘤细胞凋亡[15]。本研究RT-PCR和Western blot检测结果表明，随着0.6μmol/L浓度的纳米雄黄处理卵巢癌细胞COC1时间的延长，Caspase-3和Bax的mRNA和蛋白表达量显著增加，而凋亡抑制蛋白Bcl-2的mRNA和蛋白的表达量显著降低。该结果表明纳米雄黄促进卵巢癌细胞COC1凋亡的作用机制是通过将Bcl-2/Bax比值偏向Bax，进而促进促凋亡因子Caspase-3的表达量增加，最终达到促进COC1细胞凋亡的作用。

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Apoptosis induced by nanoparticles in ovarian cancer COC1*

Ma Shuyun1，Gao Shangfeng2，Wu Shengjun1，Zhang Shaohua1， Chen Rui1， Wang Li3,Xu Rui3

(1.Department of Gynecology,the First Affiliated Hospital of Xi′an Medical College，Xi′an，Shaanxi 710077，China;2.Department of Gynecology and Obstertrics,the First Hospital of Medicine School of Xi′anJiaotong University，Xi′an，Shaanxi 710061，China;3.Research Service Office,the First Affiliated Hospital of Xi′anMedical College，Xi′an，Shaanxi 710077，China)

Objective To explore the apoptosis induced by nanoparticles in ovarian cancer COC1.Methods 0.6μmol/L concentration treated cells COC1,cells were collected at different times.Cell morphology was observed under an inverted microscope,rate of apoptosis were detected by flow cytometry.RT-PCR to detect the mRNA expression of Bax,Bcl-2and Caspase-3in the COC1cells.Western blot to detect the protein expression of Bax,Bcl-2and Caspase-3.Results Significant apoptotic morphological changes nanoparticles 0.6μmol/L concentration appear to COC1cells after 48h;nanoparticles significantly promoted apoptosis and prolonged treatment with nanoparticles COC1cell apoptosis rate significantly increased time (P<0.05);with the extension of nanoparticles COC1cell treatments in the Bax and mRNA and protein expression levels of Caspase-3was significantly increased (P<0.05),mRNA and protein expression levels of Bcl-2was significantly decreased (P<0.05).Conclusion Nanoparticles on COC1cells have significant pro-apoptotic effect.The mechanism of action may be related to increased expression of Bax and Caspase-3,decreased expression of Bcl-2.

nanorealgar;COC1cell;Bax;Bcl-2;Caspase-3

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.29.003

陕西省自然科学基金资助项目(2012JM4051)。 作者简介：马淑云(1974-),副主任医师，在读博士，主要从事妇科肿瘤方面的研究。

R711.7

A

1671-8348(2016)29-4041-03

2016-02-22

2016-04-09)