结合珠蛋白基因多态性与未足月胎膜早破的临床研究

马少平，孔丽娜

(皖南医学院第一附属医院 弋矶山医院 妇产科，安徽 芜湖 241001)



·临床医学·

结合珠蛋白基因多态性与未足月胎膜早破的临床研究

马少平，孔丽娜

(皖南医学院第一附属医院 弋矶山医院 妇产科，安徽 芜湖 241001)

目的：探讨结合珠蛋白(haptoglobin，Hp)基因多态性与未足月胎膜早破的关系，为未足月胎膜早破的遗传病因学提供理论依据。方法：应用序列特异性引物聚合酶链反应(PCR-SSP)进行基因分型检测，分析Hp基因型Hp1-1型、Hp2-1型及Hp2-2型在正常足月分娩孕妇组(对照组)和未足月胎膜早破孕妇组(研究组)的分布。结果：等位基因Hp1和Hp2在正常孕妇和未足月胎膜早破患者的分布频率分别为39.06%、60.94%和28.0%、72.0%，两组等位基因频率和基因型频率分布差异无统计学意义(P>0.05)。结论：在中国汉族人群中，结合珠蛋白基因多态性与未足月胎膜早破发生无相关性，其基因型分布不是中国汉族孕妇未足月胎膜早破发病原因。

胎膜早破;结合珠蛋白;基因;多态性

【DOI】10.3969/j.issn.1002-0217.2016.06.014

胎膜早破(尤其是未足月胎膜早破)对母儿有较大危害。据报道胎膜早破导致的新生儿病死率和发病率分别为18%～20%和21.4%。未足月胎膜早破对母儿的影响与破膜时孕周和分娩时孕周相关，孕周越小，危害越大。结合珠蛋白(haptoglobin，Hp)，又称触珠蛋白，是一种α2唾液酸糖蛋白。Hp有三种主要的基因型：Hp1-1，Hp2-2和杂合子Hp2-1。Jin-Kyung等[1]对34例足月胎膜早破的韩国孕妇及187例正常足月孕妇进行研究，认为Hp1等位基因是胎膜早破的易感基因。目前认为足月胎膜早破与未足月胎膜早破的发病机制可能有所不同，Hp基因多态性与未足月胎膜早破的关系暂无相关报道。本研究旨在探索Hp基因多态性与未足月胎膜早破的关系，从分子生物学水平上探讨未足月胎膜早破的病因，为早预测、早预防胎膜早破提供临床诊治依据，从而降低母儿发病率及病死率。

1 资料与方法

1.1 临床资料 随机选取2014年 3月 1 日～8 月 31 日在弋矶山医院住院的25例未足月胎膜早破孕妇作为研究组,头位、无其他产科合并症，无内外科合并症，无宫颈机能不全，无宫颈环扎、羊膜腔穿刺术史，胎膜破裂前无外伤及性交等诱因。选取同期的32例正常足月待产孕妇作为对照组。对照组孕妇无产科合并症，无内外科合并症。所有对照组孕妇均随访至分娩，未发生胎膜早破及其他合并症。

1.2 主要设备和试剂 TC9600-G-230V多功能梯度PCR仪(美国Labnet)TG16。胎膜早破诊断标准参照谢幸主编的第八版《妇产科学》[2]：孕周明确，有明确阴道流液史，窥阴器检查可见液体自宫颈流出，或后穹窿处有积液，阴道液酸碱度检查pH值>6.5。微量高速离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)，引物合成参照文献，上游引物A：5′-GCTGTCACTGCTGCGTAAAG-3′；下游引物B：5′-GGTCAGTCTTTGGTTGGGTAG-3′：上游引物C：5′-CCTGCCTCGTATTAACTGCACCAT-3′；下游引物D：5′-CCGAGTGCTCCACATAGCCATGT-3′；由生工生物工程(上海)股份有限公司合成特异性引物，PCR扩增试剂盒由Promega(北京)生物技术有限公司提供；DNA提取试剂盒及DNA Markers由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。

1.3 实验方法

1.3.1 DNA提取和检测 严格依照试剂盒说明书进行操作提取，应用核酸蛋白测定仪检测所提取DNA样本。

1.3.2 PCR扩增 PCR反应体系 包括模板DNA3 μL，2.5U/L Tap DNA Polymerase 2 μL，10×Tap buffer(含Mg2+) 2.5 μL，10 μm上下游引物各0.5 μL，超纯dNTP Mixture(2.5 mmol/L each) 2 μL，加入DEPC水补至25 μL体系。引物A和B及引物C和D扩增体系相同。反应条件：引物A和B扩增时，95℃预变性5 min，95℃变性1 min，69℃退火2 min，72℃延伸2 min，共35个循环，末次循环后72℃充分延伸10 min，冷却至4℃。引物C和D扩增时，95℃预变性5 min，95℃变性1min，69℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35个循环，末次循环后72℃充分延伸10 min，冷却至4℃。

1.3.3 PCR产物Hp基因型的鉴定 取PCR扩增产物5 μL，与2 μL 6×DNA电泳Loading Buffer混合均匀后，依次点样于1.5%琼脂糖凝胶加样孔中，并点样相匹配的DNA Marker。电压80 V，电泳40 min。应用Tanon2500全自动数码凝胶图像分析系统，在紫外灯下检测并摄像，通过观察电泳图，进行Hp基因型分型。

1.4 统计学方法 按Hardy-Weinberg平衡法确定样本代表性，基因计数法计算出相对等位基因频率，等位基因频率和基因型频率分布差异采用 χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般临床资料比较 对照组与研究组之间的年龄、孕次、未生育人数比例、入院体温等差异无统计学意义(P>0.05)，未足月组孕妇无明显绒毛膜羊膜炎的表现，对照组与研究组白细胞数P=0.023，P<0.05差异有统计学意义。见表1。

表1 两组一般临床资料比较

项目对照组(n=32)研究组(n=25)年龄/岁28.47±3.9626.88±2.83孕次1.72±1.171.56±1.04未生育人数/n(%)28(87.5)25(100)体温/℃36.6±0.336.8±0.3白细胞数/(×109/L)9.33±2.2111.09±3.18

2.2 对照组孕妇Hp1-1型、Hp2-1型及Hp2-2型比例分别为21.88%、34.37%及43.75%，与我国Hp基因型分布接近。研究组孕妇Hp1-1型、Hp2-1型及Hp2-2型比例分别为16.00%、24.00%及60.00%。研究组孕妇Hp2-2型比例较对照组高，Hp1-1型较对照组低，但差异无统计学意义(χ2=1.121，P>0.05)。对照组孕妇Hp1和Hp2等位基因频率分别为0.3906和0.6094；研究组孕妇Hp1和Hp2等位基因频率分别为0.2800和0.7200，对照组与研究组差别无统计学意义(χ2=1.526，P>0.05)。见表2、3。

表2 两组Hp基因型比较 n(%)

表3 两组Hp等位基因频率比较 n(频率)

3 讨论

胎膜早破是妊娠期常见并发症，且发病率逐年升高，Liu J等2010年报道胎膜早破发生率近20%，且认为发展中国家发病率较发达国家高[3]。胎膜早破使新生儿发病率及病死率均增高，我们需要了解胎膜早破的具体发生机制及相关高危因素，从根源上减少胎膜早破的发生。研究已证实，胎膜早破和胎膜上胶原破坏及程序性细胞凋亡相关，胎膜早破的高危因素有孕妇生殖道感染、吸烟、子宫张力过大、胎膜及蜕膜上各种调节因子的作用[4-5]。近年来研究发现氧化应激系统破坏绒毛膜羊膜的结缔组织导致胎膜早破的发生[6]。

Hp是一种具有抗氧化作用的α2唾液糖蛋白，是一种急性期蛋白，在机体抗感染、修复损伤组织以及维持内环境稳定的过程中具有重要作用。Hp有Hp1和Hp2两种等位基因，主要构成三种基因型，Hp等位基因频率分布及三种基因型的分布具有种族和地理差异性，调查显示Hp1等位基因频率在东南亚人种中较低，而在非洲及南美洲频率较高[7]。赵会全等[8]在1988年对我国多个民族的Hp基因型及等位基因频率进行统计，其中汉族人中，Hp2-2型最多，占55%左右；其次为Hp2-1型，约占35%；Hp1-1型最少，约10%左右。Hp不同基因型结构不同，其功能亦存在一定差异性。

Jin-Kyung等[1]对34名韩国足月胎膜早破患者进行研究，结果显示Hp1-1基因型者，发生PROM的风险增高，其推测在未足月胎膜早破患者可能也存在这种关系，但未进行相关实验。本研究对正常足月分娩及未足月胎膜早破进行了分析。结果显示对照组Hp1-1型、Hp2-1型及Hp2-2型比例分别为21.88%、34.37%及43.75%，与我国汉族人群Hp基因型分布接近。研究组Hp1-1型、Hp2-1型及Hp2-2型比例分别为16.00%、24.00%及60.00%。研究组Hp2-2型比例较对照组高，Hp1-1型较对照组低，但差异无统计学意义。对照组Hp1、 Hp2等位基因频率为39.06%、60.94%，研究组Hp1、 Hp2等位基因频率为28%、72%，未足月组Hp2等位基因频率虽高于对照组，但差别无统计学意义。说明Hp基因多态性不是中国汉族人群发生未足月胎膜早破的高危因素。本研究就结合珠蛋白基因多态性与胎膜早破的关系进行研究，但结果与Jin-Kyung等实验结果并不一致。推测Hp基因多态性与未足月胎膜早破的发病机制可能存在种族差别，需进一步研究证实。

氧化应激在胎膜早破的发生中起到重要的作用，结合珠蛋白有明显的抗氧化作用，Hp的抗炎作用是基因型依赖性的，Hp1-1及Hp2-2各自分别主导Th2细胞反应和Th1细胞反应[9]，Hp1-1型抗氧化活性高于Hp2-2型[7]。当循环中的红细胞被破坏后释放出游离血红蛋白(Hb)，Hp可与游离Hb结合形成稳定的Hp-Hb复合物，Hp-Hb复合物具有氧化还原活性，可终止氧化损伤。循环中的Hp-Hb复合物与单核巨噬细胞表面特异性受体CD163结合后，被单核巨噬细胞吞噬清除[7]。研究显示，Hp-Hb复合物与CD163受体结合可提高炎症抑制因子白介素10的表达[10]。Hp-Hb复合物对CD163的亲和力也是基因型依赖性的，而Hp2-2基因型对CD163有较高亲和力[11]。推测Hp1等位基因可能为胎膜早破的保护性基因，Hp2-2基因型发生胎膜早破的风险大于其他基因型。本研究虽然结果显示在未足月胎膜早破组中Hp2-2基因型所占比例大于正常对照组，但差异亦无统计学意义，可能和本研究中样本较少有关。

本研究仅对中国安徽地区汉族孕妇做出相关分析，但其是否可能参与其他种族或其他地区未足月胎膜早破的发生仍需进一步研究，全面评价Hp基因多态性与未足月胎膜早破之间的关系尚需更多更全面的研究。

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Clinical study of haptoglobin polymorphism with preterm premature rupture of membranes

MA Shaoping，KONG Li′na

Department of Gynecology & Obstetrics,The First Affiliated Hospital of Wannan Medical College,Wuhu 241001,China

Objective：To investigate the association of allelic polymorphism of haptoglobin(Hp)with preterm premature rupture of membrane(PPROM) for genetic evidence leading to PPROM.Methods:PCR techniques with sequence specific primers(SSP) was used to detect genotype Hp1-1,Hp2-1and Hp2-2 in human Hp gene and their distribution in normal pregnancy and PPROM.Results:The frequencies of Hp1 and HP2 alleles were 39.06% and 60.94% for the normal pregnancies,and 28% and 72% for the test group,respectively.There was no significant difference in the genotype distribution(P>0.05)and allelic frequencies (P>0.05) between groups.Conclusion：The findings showed no association of haptoglobin polymorphism with PPROM,suggesting that this gene distribution may not be the risk factor of pregnant women in Han population complicated with PPROM.

premature rupture of membrane;haptoglobin;gene;polymorphism

1002-0217(2016)06-0559-03

2016-03-22

马少平(1978-)，女，主治医师，(电话)15395362963，(电子信箱)35092714@qq.com.

R 714.433

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