天然产物在骨肉瘤体外研究中的现状

魏 兴，王春江，曹 波

(1.包头医学院，内蒙古包头 014040；2.包头市第四医院；3.武警后勤学院救援医学系生药学教研室)



天然产物在骨肉瘤体外研究中的现状

魏 兴1，王春江2，曹 波3

(1.包头医学院，内蒙古包头 014040；2.包头市第四医院；3.武警后勤学院救援医学系生药学教研室)

骨肉瘤化疗的整体有效率仍大约在60 %，主要原因是化疗药毒副作用和肿瘤细胞耐药问题。其他问题包括二线化疗药的缺少、化疗风险评估、化疗新方案等问题也仍待解答。天然产物作为自然界中由活生物产生的具有药理学或生物学活性的化学物质，可被用于药学上的药物研发与药物设计，其优势在于细胞毒性小。本文着重描述近年来骨肉瘤治疗中天然产物领域的发展，其中包括芹菜素、b榄香烯、褐藻素、人参皂苷RF、齐墩果酸OA、川续断、碱提取物、九节茶提取物、非洲防己胺、甲基莲心碱、白英萃取物、叶下珠萃取物、卷柏提取物丹参酮ⅡA等等的抗骨肉瘤作用及其机制。

骨肉瘤是青少年最常见的骨恶性肿瘤，约占青少年骨恶性肿瘤的60 %，通常发生在青春期的快速发育期。目前认为骨肉瘤的发病与染色体异常、抑癌基因异常、转录因子、生长因子、多蛋白配偶体等有关[1]。目前骨肉瘤最常见的治疗方案是术前化疗-手术切除所有病灶(包括转移灶)-术后化疗。

虽然化疗在骨肉瘤的治疗中具有举足轻重的作用, 但骨肉瘤化疗的总体有效率仍徘徊在60 %左右。制约其疗效的主要因素有两方面：一是高剂量强度所导致的严重的毒副作用,由于化疗药物个体差异较大,有效剂量与中毒剂量十分接近,因此相同剂量对于不同个体可能发生严重的粒细胞和(或)血小板下降。二是肿瘤细胞原发或继发耐药问题,也是化疗失败的主要原因。因此，抗耐药、新的治疗方法、二线化疗药等问题亟待解决，从天然药物中寻找安全有效的抗肿瘤药物可为骨肉瘤的治疗开辟一条新的途径[1]。

天然产物是指自然界中由活生物产生的那些通常具有药理学或生物学活性的化学物质，可被用于药学上的药物研发与药物设计。包括蛋白质、多肽、氨基酸、核酸、各种酶类、各种糖类、各种脂类、生物碱、挥发油、黄酮、糖苷类、萜类、苯丙素类等等天然存在的化学成分。其中黄酮类、生物碱类、挥发油类等多种类型天然产物已经证明在抗乳腺癌、肺癌等方面有效，本文将介绍天然产物抗骨肉瘤方向的新进展。

1 黄酮类

芹菜素，别名4,5,7-三羟基黄酮，属黄酮类，有研究[2]指出芹菜素对人骨肉瘤细胞U-2OS有抗癌特性，芹菜素可时间-剂量依赖性介导骨肉瘤细胞死亡，DAPI染色提示芹菜素有效介导了细胞凋亡，并改变了ROS和细胞内Ca2+水平，增加BAX，caspase-3、8、9、12，AIF，PARP，p53，GRP78，ATF4的表达，并降低了caspase-3,caspase-9，GADD153基因的表达。并且芹菜素可抑制给予U2-OS异基因肿瘤的裸鼠的肿瘤生长。此外，有研究者认为染料木素，一种从大豆中提取出的异黄酮，可抑制肿瘤转移，TerukiKidani等[3]将染料木素处理过的鼠骨肉瘤细胞LM8(染料木素组)与未处理过的LM8(对照组)各接种8只裸鼠背上进行对照研究。结果发现，与对照组相比，染料木素组的肿瘤仅是对照组肿瘤大小的23 %，HE染色发现对照组100 %存在肺转移，87.5 %存在肝转移，染料木素组仅1例出现肝转移。继而对照组和染料木素组进行免疫组化检测发现，对照组中MMP-2显著高于染料木素组。对照组中53 %的细胞呈β-catenin阴性，剩余47 %细胞的β-catenin亮度也不如染料木素组，染料木素组中82 %的肿瘤细胞β-catenin亮度呈阳性并且亮度明显强于对照组；在转移灶中β-catenin也呈阳性，但是亮度很弱。由此认为，染料木素可使LM8细胞中β-catenin过度表达和MMP-2减低，进而抑制骨肉瘤细胞增长和转移。黄芩素是半枝莲的主要成分之一，是天然黄酮类化合物，Tang等[4]发现，黄芩素可剂量依懒性抑制MG-63人骨肉瘤细胞的增殖，并且随着给药剂量的增加，ezrin蛋白的mRNA和蛋白表达水平均下降，凋亡指数却上升。考虑黄芩素抑制人骨肉瘤细胞的增殖与抑制ezrin蛋白表达和活性，促进细胞凋亡有关。黄酮类多通过凋亡通路抑制骨肉瘤细胞增殖，目前针对黄酮类的研究仍处于体外实验和动物实验阶段。

2 挥发油类

有文献指出β榄香烯、褐藻素可抑制骨肉瘤细胞传代的细胞活性，褐藻素可抑制细胞转移和骨肉瘤细胞的侵入性。Dan等[5]研究β榄香烯的骨肉瘤的抗癌作用和分子机制时发现，β榄香烯是通过细胞凋亡抗骨肉瘤的，并且具有时间-剂量依赖性。但同时发现β榄香烯治疗通过活性氧簇和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路，上调低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)蛋白，HIF-1α蛋白抑制了凋亡。在通过微核糖核酸或联合HIF-1α抑制剂利非西呱下调HIF-1α后可明显增强抗肿瘤效果。因此认为β榄香烯可以增加HIF-1α表达，β榄香烯抗肿瘤效果被弱化，进而认为可选择β榄香烯合并HIF-1α抑制剂治疗骨肉瘤。在类胡萝卜素中[6]，褐藻素通过介导周期调节蛋白依赖性激酶4、周期调节蛋白依赖性激酶6和周期调节蛋白E的表达减少来阻断G1细胞周期，通过减低存活素、X连锁凋亡抑制蛋白、Bcl-xL、Bcl-2的表达、激活caspases-3、8、9实现骨肉瘤细胞凋亡。此外，褐藻素还抑制磷酸肌醇依赖性激酶1和AKt和下游糖原合酶激酶3β的磷酸化，导致β-链蛋白的下调。同时减少基质金属蛋白酶1(matrix metalloproteinase-1，MMP-1)和活性蛋白1信号通路的表达，进而抑制细胞转移和骨肉瘤细胞的侵入性。

3 多糖类

Chen等[7]从川续断的碱提取物中提纯得到一种碱性水溶性多糖提取物，可介导骨肉瘤HOS细胞的凋亡、降低线粒体膜电位并且显著增加细胞内活性氧簇含量。Western blot分析显示碱性水溶性多糖提取物下调了HOS细胞磷脂酰肌醇3-激酶的蛋白表达和蛋白激酶B的磷酸化。在另一种天然产物提取物-九节茶提取物酸性多糖SGP-2抗骨肉瘤细胞MG-63的研究发现[8]，SGP-2通过caspase途径激活caspase-3一定程度上介导骨肉瘤细胞凋亡，并且SGP-2抗骨肉瘤效果可被泛caspase抑制剂Z-VAD-FMK阻断。此外SGP-2还可通过抑制RAGE和NF-kB信号通路抑制肿瘤细胞转移能力。

4 生物碱类

Bao等[9]对非洲防己胺研究发现在给予21.31±0.38 μM(IC50)COL时可有效地抑制了U20S细胞增殖并且细胞毒性较低，还可抑制转移性骨肉瘤细胞的增殖和血管生成。COL介导阻断G2/M细胞周期却并没有促进U20S细胞凋亡的作用，COL可抑制CDK6基因表达并刺激GM-CSF抑制STAT3磷酸化，但并不改变STAT3的蛋白水平。此外COL下调基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)表达并且通过抑制骨肉瘤细胞转移、黏附和侵入抑制U20S细胞介导的血管生成。与非洲防己胺相同，甲基莲心碱[10]虽然对骨肉瘤细胞的生长抑制作用明显，但同样不是通过介导细胞凋亡实现的，抑制作用通过的是阻断细胞周期G1。G1期的阻断是P21WAF1/CIP1依赖性的，与P53和RB无关。甲基莲心碱激活P38、MAPK和JNK上调了P21，增加了P21蛋白的半衰期。并且，只有SB203580(一种P38抑制剂)，可以作用于甲基莲心碱来减弱P21的上调。西法安生，是一种头花千金藤的生物碱提取物，已应用于抗炎药物中，Chen等[11]研究发现，西法安生可通过阻断G1期和促进凋亡途径抑制骨肉瘤细胞(时间-依赖型)，并且G1期的阻断发生更早，所需剂量更小，因此可能G1期的阻断占主导地位。研究者进行westernblot法和荧光素法均发现西法安生可抑制细胞内STAT3水平，并抑制其靶基因c-Myc、cyclin D1、和Bcl-xL的表达，进而促进细胞凋亡。针对生物碱类天然产物的研究十分广泛，这说明生物碱类抗肿瘤药物的研究前景光明，可能会成为骨肉瘤治疗的十分重要的发展方向。

5 萜类

Zhou等[12]对齐墩果酸OA研究发现，OA可抑制细胞增殖和集落形成，剂量和时间相关性介导阻断骨肉瘤MG63和Saos-2细胞的G1期。在G1到S期转位中扮演了重要角色的细胞周期蛋白D1，同时作为mTOR复合体1的下游靶点，其蛋白水平在OA的作用下降低。OA还可抑制磷酸化P70染色体S6激酶1和S6(S235/236),其受到mTORC1信号介导控制蛋白翻译和细胞生长。此外，OA抑制Akt的磷酸化(一种mTORC2的促存活因子和色素)，Akt通过增加膜联蛋白V-FITC捆绑，多聚腺苷二磷酸核糖、聚合酶的裂解和caspase-3的激活，证明蛋白激酶B的失活与骨肉瘤细胞的促凋亡相关。

6 其他天然产物及其提取物

Lin等[13]发现白英萃取物具备对人骨肉瘤细胞U-2OS细胞毒作用，这些作用包括细胞形态学改变，细胞存活率减低和介导凋亡。DAPI染色结果和流式细胞术发现sub-G1相增高说明SLE介导的细胞的死亡与细胞凋亡关系密切，研究表明SLE促进活性氧和NO的产生并降低了caspase-8和9的活性，还可抑制了Bcl2的水平和升高Bax水平，进而从线粒体释放细胞色素c到胞质并且激活caspase-9和3，导致从线粒体途径介导细胞凋亡。该学者认为SLE促进ROS产生并通过线粒体、caspase途径杀死U-2OS细胞。

肿瘤的转移通常起源于细胞外基质和基底膜的破坏导致的肿瘤侵袭和迁移，这种破坏是由多种溶蛋白酶的增效作用引起的，其中包括基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)。Yang等[14]对卷柏提取物研究发现，卷柏提取物浓度在0～50l g/mL间可抑制骨肉瘤细胞的转移和侵犯并且无细胞毒性。基于对于MMP的认识及研究，该学者发现卷柏提取物抑制了MMP-2和MMP-9的分泌和TIMP-1和TIMP-2的表达，进一步抑制p38和Akt磷酸化，但对JNK1/2和ERK1/2没有效果。在分别给予了p38和PI3K抑制剂后，骨肉瘤细胞的转移和侵犯同样被抑制，这也验证了上述观点。丹参酮提取物已经被证实没有严重的副作用，并具备一定的抗肿瘤作用，Zhang等[15]研究发现丹参酮IIA可时间-浓度依赖性抑制骨肉瘤细胞的增殖、转移和浸润，并可介导凋亡，浓度仅为5 μmol/L即可显著抑制MG-63细胞增殖，丹参酮IIA可激活Bax并抑制Bcl-2表达，还可显著增加caspase-3、8、9的表达，促进骨肉瘤细胞凋亡。丹参酮IIA还可抑制MMP-2、MMP-9的信使核糖核酸和蛋白表达，这意味着丹参酮IIA也许可以用于抑制骨肉瘤的侵袭和转移。

天然产物作为崭新的治疗手段，为骨肉瘤患者带来希望，但要运用于临床，还有很多问题需要解决,如很多天然产物治疗缺乏特异性靶向，如何开发更多的对骨肉瘤治疗有效的靶向通路，如何更好地降低细胞毒性，如何提高天然产物的治疗效率，更重要的是，目前天然产物在骨肉瘤方面的研究尚处于细胞试验和动物实验阶段，研究仍处于起步阶段，有些天然产物在体外试验中的表达效率是否在体内同样适用仍然存疑。对于药物疗效、细胞毒性等方面都面临着许多问题，还有待进一步深入研究。只有选择合适的治疗方式，建立起个体化的治疗方案，天然产物对骨肉瘤的治疗才能取得突破性的进展，骨肉瘤的天然产物治疗才能真正用于临床。

[1] Anninga JK,Gelderblom H,Fiocco M,et al.Chemotherapeutic adjuvant treatment forosteosarcoma:Where do we stand[J].European Journal of Cancer,2011,47:2431-2445.

[2] Chin CL,Ya JC,Chien CY.Apigenin Induces Apoptosis through itochondrial Dysfunction in U-2 OS Human Osteosarcoma Cells and Inhibits Osteosarcoma Xenograft Tumor Growth in Vivo[J].J Agric Food Chem,2012,60:11395-11402.

[3] Teruki K,Atsushi N,Setsuya K,et al.Overexpression of cytoplasmic β-catenin inhibits the metastasis of the murine osteosarcoma cell line LM8[J].Cancer Cell International,2014,14:31-40.

[4] Tang Z,Li C,Chen Z.Inhibitory effect of baicalein on the proliferation and invasion of osteosarcoma cells and mechanism[J].Xi Bao Yu Fen ZiMian Yi Xue Za Zhi,2015,31(3):342-345.

[5] Dan L,Maowei Y,Baolei G.HIF-1α induced by β-elemene protects human osteosarcoma cells from undergoing apoptosis[J].J Cancer Res Clin Oncol,2012,138:1865-1877.

[6] Takayoshi R,Ryuichiro K,Chie I.Anticancer effects of marine carotenoids, fucoxanthin and its deacetylated product,fucoxanthinol,on osteosarcoma Liang.Internation Journal of Oncology,2013,15:1176-1186.

[7] Jun C,Dong Y,Huixin Y，et al.Dipsacus asperoides polysaccharide induces apoptosis in osteosarcoma cells by modulating the PI3K/Akt pathway [J].Carbohydrate Polymers.2013,95(2):780-784.

[8] Zhenzhen Z,Wei L,Ying Z,et al.SGP-2,an acidic polysaccharide from Sarcandraglabra, inhibits proliferation and migration of human osteosarcoma cells[J].Food Funct,2014,5(1):167-175.

[9] Meimei B,Zhifei C,Di Yua.Columbamine suppresses the proliferation and neovascularization of metastaticosteosarcoma U2OS cells with low cytotoxicity[J].Toxicology Letters,2012,215:174-180.

[10] Xiyu Z,Zhaojian L,Bing X.Neferine,an alkaloid ingredient in lotus seed embryo, inhibits proliferation of human osteosarcoma cells by promoting p38 MAPK-mediated p21 stabilization[J].European Journal of Pharmacology,2012,677: 47-54.

[11] Chen Z,Huang C,Yang YL,et al.Inhibition of the STAT3 signaling pathway is involved in the antitumor activity of cepharanthine in SaOS2 cells[J].ActaPharmacol Sin,2012,33(1):101-108.

[12] Rongping Z, Zhongmin Z,Li Z.Inhibition of mTOR Signaling by Oleanolic Acid Contributes to Its Anti-Tumor Activity in Osteosarcoma Cells[J].Journal Of Orthopaedic Research,2011:846-852.

[13] YiTing L,AnCheng H,ChaoLin K.Induction of Cell Cycle Arrest and Apoptosis in Human Osteosarcoma U-2 OS Cells by Solanumlyratum Extracts[J].Nutrition and Cancer,2013,65(3),469-479.

[14] JiaSin Y, ChiaoWen L,YihShou Hsieh,et al.Selaginellatamariscina (Beauv.) possesses antimetastatic effects on human osteosarcoma cells by decreasing MMP-2 and MMP-9 secretions via p38 and Akt signaling pathways[J].Food and Chemical Toxicology,2013,59:801-807.

[15] 赵亚恒,冯和林,郑丽华,等.骨肉瘤发病机制的研究进展[J].肿瘤防治研究，2014,41 (3):283-286.

王春江,曹 波

2015-09-29)