油茶根际土壤解磷菌的筛选、鉴定及培养条件

刘小玉，付登强，贾效成，陈良秋

(中国热带农业科学院椰子研究所，海南 文昌 571339)



油茶根际土壤解磷菌的筛选、鉴定及培养条件

刘小玉，付登强，贾效成，陈良秋

(中国热带农业科学院椰子研究所，海南 文昌 571339)

从油茶根际土壤中分离筛选出7株溶磷细菌，根据透明圈法和钼锑抗比色法综合分析，最终得出菌株4-Y-06溶磷活性最强。通过菌落形态特征、生理生化特征、16S rDNA序列和系统发育分析等研究，初步鉴定菌株 4-Y-06为嗜气芽孢杆菌。同时，研究了不同碳源、氮源、C/N、pH、以及温度等不同培养条件对菌株4-Y-06溶磷效果的影响。结果表明：解磷菌4-Y-06 在碳源为蔗糖、氮源为硫酸铵、C/N为40:1、pH 7.0～7.5、30 ℃条件下解磷效果最好。

解磷菌；碳源；氮源；培养条件

油茶是我国南方特有的木本油料作物，与油棕、油橄榄、椰子并称为世界四大木本油料作物。近年来，我国食用植物油消费量持续增长，需求缺口不断扩大，食用植物油安全问题日益突出。油茶作为我国种植面积最大、产油量最高的木本油料作物，是健康优质食用油的重要来源。因此努力发展油茶产业提升我国食用油自给率，保障国家食用油安全具有重要意义。磷是是影响作物产量的重要限制因子之一，土壤缺磷直接影响农作物的生长。我国缺磷耕地面积占74 %，且土壤中95 %以上的磷为无效态，很难被植物直接吸收利用[1]。但是土壤与植物根际中存在大量解磷菌，能够将植物难以吸收利用的磷转化为易被植物吸收利用的磷[2]。有研究表明海南油茶在低磷条件下可正常生长，未表现出明显的缺磷症状[3]。此外，也有研究表明油茶根际土壤中存在溶磷菌[4]，油茶根际溶磷菌的高效溶磷作用可能是油茶适应低磷胁迫的重要机理之一。

施用解磷微生物能够溶解土壤中难溶性磷，提高土壤有效磷含量，促进作物生长[5-7]。但不同种类的解磷菌，不仅解磷能力存在巨大的差异，而且解磷机理也可能不一样。另外，培养基中碳源[8]、氮源、磷源和无机盐[9]等也会影响解磷菌生长或改变其生理代谢途径，从而影响其解磷效果。也有学者认为微生物的解磷能力可能与它分泌有机酸类物质有关，也可能存在多个解磷机理[10]。本实验通过研究不同碳源、氮源、C/N、pH值及温度对菌株4-Y-06溶磷效果的影响，建立菌株4-Y-06的扩繁技术体系，可为生产上研制油茶专用溶磷菌肥提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集

供试土壤采自五指山南圣、水满等地油茶林的油茶根际土壤。

1.2 溶磷细菌的筛选与鉴定

1.2.1 溶磷细菌的分离与筛选 采用稀释平板法进行溶磷菌的分离，溶磷圈法定性分析菌株的溶磷能力，钼锑抗比色法定量测定溶磷菌的溶磷能力，具体方法详见参考文献[11]。菌株溶磷能力的计算公式如下：

P=K×V/V1

其中：P为有效磷增量；K为从标准曲线查得显色液的磷含量(mg/L)；V为显色时溶液定容的体积(mL)；V1为显色时吸取上清液的体积(mL)。

1.2.2 溶磷细菌的鉴定 参照《常见细菌系统鉴定手册》对菌株4-Y-06的菌落形态特征及主要生理生化特征进行试验和观察记录。采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株4-Y-06的DNA。PCR 扩增选用通用引物27 F 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492 R 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。反应体系50 μl (1μl模板、1 μl 1492 R、1 μl 27 F、25 μl PCR mastermix、22 μl ddH2O)。将PCR 产物送至华大基因科技股份有限公司进行测序。经测序获得溶磷菌株4-Y-06的16S rDNA序列，将该序列通过Blast程序与GenBank中核酸数据进行比对分析(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi),采用BioEdit、Mega5.0等软件对菌株进行系统发育分析，采用邻接法(Neighbour-joining,NJ法)构建系统发育树。

1.3 不同培养条件对菌株菌株4-Y-06溶磷能力的影响

1.3.1 不同碳源对菌株4-Y-06溶磷能力的影响 以有机磷培养基为基础培养基，分别设葡萄糖、果糖、可溶性淀粉、蔗糖、麦芽糖、乳糖等为碳源，均以等量碳量加入培养基中。于28 ℃、200 r/min摇床发酵培养7 d后测定菌株4-Y-06数量、菌液pH和水溶性磷含量。

1.3.2 不同氮源对菌株4-Y-06溶磷能力的影响 以有机磷培养基为基础培养基，分别设硝酸钾、硫酸铵、尿素、硝酸铵等为氮源，均以等量氮量加入培养基中。于28 ℃、200 r/min摇床发酵培养7 d后测定菌株4-Y-06数量、菌液pH和水溶性磷含量。

1.3.3 不同C/N对菌株4-Y-06溶磷能力的影响 以有机磷培养基为基础培养基，分别以葡萄糖和硫酸铵为碳源和氮源，设C/N为40∶1、20∶1、8∶1等3种处理。于28 ℃、200 r/min摇床发酵培养7 d后测定菌株4-Y-06数量、菌液pH和水溶性磷含量。

1.3.4 不同pH对菌株4-Y-06溶磷能力的影响 以有机磷培养基为基础培养基，将基础培养基的pH值分别设为5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，于28 ℃、200 r/min摇床培养7 d后测定菌株4-Y-06数量、菌液pH和水溶性磷含量。

1.3.5 不同温度对菌株4-Y-06溶磷能力的影响 以有机磷培养基为基础培养基，将培养温度设为24、26、28、30、32、34、36 ℃，然后置于200 r/min摇床培养7 d后测定菌株4-Y-06数量、菌液pH和水溶性磷含量。

1.3.6 菌体数量、pH和水溶性磷含量的测定 将培养7 d后的菌液低速(1500 r/min)离心3 min，然后取4 mL 菌液用等体积1 mol/L HCl稀释，目的是除去上清液中残留的碳酸钙颗粒，采用平板计数法计算菌株的数量。剩余的菌液再经10 000 r/min离心10 min后用pH计测定上清液pH值，最后用钼锑抗比色法测定上清液中水溶性磷含量。

1.4 数据处理

数据采用Excel和SAS软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 溶磷细菌的分离纯化

共分离筛选出7株能产生明显溶磷圈的细菌，对7株细菌的形态进行观察，用溶磷圈法对各菌株的D/d值进行测定(表1)。另外，菌株4-Y-06在有机磷培养基上出现的透明圈如图1。

2.2 溶磷细菌的溶磷能力

各菌株发酵培养7 d后测定其有效磷含量，结果(表2)发现7株溶磷菌溶解有机磷能力差异显著，有效磷含量在 34.76～168.74 mg/L，与不接菌对照(23.99 mg/L)相比，有效磷增量在10.77～144.75 mg/L，增幅在44.8 %～603.4 %。菌株4-Y-06的溶磷量为168.74 mg/L，比CK增加了7倍，溶磷效果显著高于其他菌株。

2.3 菌株鉴定

2.3.1 菌株4-Y-06的形态特征 菌株4-Y-06在LB培养基上生长较好，速度快，培养48 h后，菌落为圆形，乳白色，不透明，湿润，扁平，无色素产生，菌落小。

表1 溶磷菌培养7 d的菌落特征

注：1)快-12 h后可观察到生长，中等-24 h可观察到生长，慢—48 h后可观察到生长 ；2)+生长较差，++生长一般，+++生长良好。

Note:1)Fast-growth is observed after 12 hours, medium-growth is observed after 24 hours, slow-growth is observed after 48 hours;

2)+ poor growth, ++ growth generally,+++ good growth.

图1 菌株4-Y-06在有机磷培养基上的溶磷圈Fig.1 Phosphate dissolving circle of strain 4-Y-06 in medium

2.3.2 菌株4-Y-06的生理生化特征 菌株淀粉水解试验、吲哚试验、V-P试验、明胶液化试验、H2S试验呈阴性；过氧化氯酶试验、硝酸盐还原试验、氧化酶试验呈阳性；能利用葡萄糖。

2.3.3 16S rDNA序列测定及其系统发育分析 将菌株4-Y-06的16S rDNA进行PCR扩增得到一条1500 bp左右的条带，经序列测定，其大小为1351 bp。经BLAST相似性分析，发现菌株 4-Y-06与GenBank中的AJ831844(Bacillusaerophilus28KT)同源性最高，相似性达100%。根据同源性从高到低的院长，挑取7株菌株的16S rDNA序列，运用BioEdit、Mega5.0等软件构建系统发育树(图2)

表2 有机磷液体培养基中接种7 d的溶磷量

注：同列数据后不同小写字母表示0.05水平上的差异显著性，下同。 Note:Different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level. The same as below.

2.4 不同培养条件对菌株4-Y-06溶磷能力的影响

2.4.1 不同碳源对菌株4-Y-06溶磷能力的影响 从表3可见，不同碳源显著影响解磷菌的溶磷能力。当以蔗糖为唯一碳源时，菌株4-Y-06表现出最强的解磷能力，溶磷量可达179.75 mg/L。供试的6 种碳源对菌株4-Y-06解磷效果的高低顺序为：蔗糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖、可溶性淀粉、乳糖。菌体生长量变化趋势与溶磷量相似，蔗糖为唯一碳源时解磷菌的生长量显著高于其他碳源。综合溶磷量和菌株数量可以看出，蔗糖为碳源时菌株4-Y-06溶磷能力最强。另外，各处理培养7 d后发酵液的pH值均下降，以蔗糖处理的降幅最大，pH 5.82，这有可能是菌株4-Y-06在发酵过程中不断产生有机酸，从而引起发酵液的pH下降。

2.4.2 不同氮源对菌株4-Y-06溶磷能力的影响 从表4可以看出，不同氮源显著影响解磷菌的溶磷能力，其中以硫酸铵为唯一氮源时，菌株4-Y-06的溶磷量达到最高(168.43 mg/L)，同时培养介质pH值的降幅和发酵液中菌株4-Y-06的数量也分别达到最大。可能是不同氮源影响了菌株4-Y-06的代谢途径，从而改变其分泌的次生代谢产物组分，最终表现出不同的解磷能力。

图2 菌株4-Y-06的同源性分析Fig.2 Homology analysis of strain 4-Y-06

碳源Carbonsources溶磷量(mg/L)Phosphatesolubilizationcapacity菌株数量(cfu/mL)NumberofstrainspH葡萄糖167.51b2.3×1010a6.12±0.06果糖115.48c5.7×109b6.30±0.12可溶性淀粉52.53c3.2×107d6.12±0.09蔗糖179.75a4.6×1010a5.82±0.08麦芽糖68.68d2.9×108c6.19±0.18乳糖34.62f4.6×106e6.03±0.06

2.4.3 不同C/N对菌株4-Y-06溶磷能力的影响 表5表明，菌株4-Y-06溶磷能力随着C/N的减小而显著减少，当C/N为40∶1时，其溶磷量最高，达到184.35 mg/L，是C/N为20∶1处理的1.13倍，C/N为8∶1处理的2.21倍，但是从培养介质的pH变化来看，3个处理之间相差不大。菌体数量在C/N为40∶1时达到最大，8∶1时较少。

2.4.4 不同pH对菌株4-Y-06溶磷能力的影响 表6表明，不同pH显著影响菌株4-Y-06的溶磷能力，其中pH为7.0时，溶磷量达到最大(171.43 mg/L)，pH为7.5时次之(162.78 mg/L)。pH为7.0和7.5时菌株数量显著大于其他处理，综合溶磷量及菌株数量可以看出，菌株4-Y-06最适pH为7.0～7.5。此外，各处理的终pH值均比初始pH小，有可能是菌株4-Y-06在发酵过程中产生有机酸，导致pH值降低。

2.4.5 不同温度对菌株4-Y-06溶磷能力的影响 表7表明，不同温度显著影响菌株4-Y-06的溶磷能力，当温度为30 ℃时，其溶磷量达到最大(183.78 mg/L)，菌株数量也达到最高(4.3×1010cfu/mL)，说明菌株4-Y-06最适温度为30 ℃。各处理后发酵液的pH值差异不显著，但均比初始pH值小，可能是发酵过程中产有机酸的原因。

3 讨 论

郝晶等[12]认为菌株的D值，D/d和溶磷量之间并不总是呈正相关关系。本研究结合溶磷圈法和钼锑抗比色法综合分析，最终筛选出一株解磷效果最强的菌株4-Y-06。然而，解磷微生物的解磷作用并不是一成不变的，随着外界环境或是营养物质的变化，会改变解磷菌的生长代谢途径，甚至影响解磷菌的生长和繁殖，从而导致解磷效果的不稳定。有关研究表明，溶磷能力的大小主要是由菌株的特性所决定的，在不同的条件下，菌株的解磷能力有很大差异[13]。此外，虞伟斌等[14]报道同一株磷细菌在不同的碳氮源或C/N时表现的解磷能力并不一致，解磷菌表现出的解磷能力与其所处环境有很大关系。赵小蓉等[13]研究表明，菌体的生长量与溶磷量间并不是总成正相关关系，有时有机酸的作用更大。不同的碳源会改变菌株分泌有机酸种类，Patel等[15]发现Citrobactersp. DHRSS解磷菌以蔗糖和果糖为碳源时主要分泌乙酸，当以葡萄糖和麦芽糖为碳源时主要分泌葡萄糖酸。刘晓芳等[16]报道，两株黑曲霉ML2、ML4随着C/N的增加，菌体生长量随之增大，菌株的溶磷量先是随C/N的升高而升高，后又降低，在C/N为35∶1时达到最大。本研究发现菌株4-Y-06在碳源为蔗糖、氮源为硫酸铵、C/N为20∶1的培养条件下更适合发挥其解磷作用，说明不同的菌株都有自身最适合的培养条件。此外，经研究发现，各处理经发酵7 d后，上清液pH值均比初始pH值低，这有可能是菌株4-Y-06在发酵过程中不断产生有机酸，有机酸不断溶解培养基中的不溶性卵磷脂，致使发酵液中的可溶性磷含量不断增加，有机酸的不断产生同时引起发酵液的pH值下降，这与贺梦醒[17]的研究结果基本一致。

表4 不同氮源对菌株4-Y-06溶磷效果的影响

表5 不同C/N对菌株4-Y-06溶磷效果的影响

表6 不同pH对菌株4-Y-06溶磷效果的影响

表7 不同温度对菌株4-Y-06溶磷效果的影响

4 结 论

采用溶磷圈法和钼锑抗比色法综合分析，最终得出菌株4-Y-06溶磷活性最强。结合菌株4-Y-06的菌落形态特征、生理生化试验、16S rDNA序列分析及系统发育分析等研究，初步鉴定菌株4-Y-06为嗜气芽孢杆菌(Bacillusaerophilus)。且经研究表明菌株4-Y-06在碳源为蔗糖、氮源为硫酸铵、C/N为40∶1、pH 7.0～7.5、30 ℃条件下解磷效果最好。

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(责任编辑 李 洁)

Isolation, Identification and Culture Condition of Phosphate-solubilizing Bacteria Derived from Camellia Rhizosphere Soil

LIU Xiao-yu，FU Deng-qiang，JIA Xiao-cheng, CHEN Liang-qiu

(Coconut Research Institute, CATAS, Hainan Wenchang 571339，China)

Seven strains phosphate solubilizing bacteria were screened from the rhizosphere of camellia , and strain 4-Y-06 with the highest capacity of solubilizing phosphate was gained, by utilizing the method of transparent zone and molybdenum-antimony anti-spectrophotometric. According to morphology of the colony , physiological and biochemical properties, 16S rDNA and phylogenetic analysis, Strain 4-Y-06 was identified asBacillusaerophilus. In addition, the ability of phosphate solubilization by strain 4-Y-06 was studied with different cultivation conditions including differenr carbon sources,nitrogen forms,C/N,pH,temperatures. The results showed that strain 4-Y-06 had the highest capacity of phosphate solubilization when sucrose was used as carbon source,ammonium sulfate was used as nitrogen form,C/N was 40∶1，pH was 7.0-7.5 and the temperature was 30 ℃.

Phosphate solubilizing bacteria；Carbon source；Nitrogen form；Cultivation condition

1001-4829(2016)11-2637-06

10.16213/j.cnki.scjas.2016.11.023

2015-12-28

海南省产学研一体化专项项目(cxy20150020)

刘小玉(1986-),女,江西九江人，硕士研究生,研究实习员,主要从事土壤微生物与油茶丰产栽培技术研究，E-mail:liuxiaoyu06120210@163.com。

S714.4

A