马氏珠母贝近交与杂交家系的DNA甲基化多态性比较

罗少杰，张鹏飞，焦 钰，王庆恒,2，杜晓东,2，邓岳文,2

（1.广东海洋大学水产学院，广东 湛江 524088；2.广东省珍珠养殖与加工工程技术研究中心，广东 湛江 524025）

马氏珠母贝近交与杂交家系的DNA甲基化多态性比较

罗少杰1，张鹏飞1，焦 钰1，王庆恒1,2，杜晓东1,2，邓岳文1,2

（1.广东海洋大学水产学院，广东 湛江 524088；2.广东省珍珠养殖与加工工程技术研究中心，广东 湛江 524025）

采用甲基化敏感多态性扩增技术（MSAP）检测马氏珠母贝（Pinctada fucata martensii）近交（F1）与杂交（Z1）家系闭壳肌的 DNA甲基化修饰水平，对部分甲基化修饰片段进行回收、测序和注释分析。结果表明：使用20对引物进行选扩增PCR，最终F1和Z1分别获得（632.20 ± 22.58）和（588.60 ± 25.09）条条带，差异显著（P＜0.05）；F1和Z1之间的组织甲基化水平分别为（9.93 ± 1.60）%和（8.04 ± 1.25）%，差异显著（P＜0.05）。对回收片段进行注释，F1家系共获得9条甲基化修饰片段，其中8条为功能蛋白，分别为E3泛素连接酶、逆转录病毒多聚蛋白、神经肽受体、交叉结点核酸内切酶、磷酸糖器、苯丙氨酸解氨酶、隐花色素蛋白、脆性位点相关蛋白；Z1家系共获得5条甲基化修饰片段且均为功能蛋白，分别为脆性位点相关蛋白、神经元乙酰胆碱受体α亚基、无调性的同源蛋白、麦芽糖酶、甲基胞嘧啶双加氧酶。初步阐明马氏珠母贝近交家系F1与杂交家系Z1间的DNA甲基化修饰水平和部分具甲基化修饰位点。

马氏珠母贝；近交家系；杂交家系；MSAP

在育种学中，杂交是改良动、植物种质的重要手段，能使两个具不同遗传背景的亲本产生的杂种子一代在生长势、生活力、生殖力、产量和品质等方面优于双亲或亲本的一方，即杂种优势[1]。目前，越来越多的研究表明杂种子一代的优良性状表现与基因表达有直接联系[2-3]，而基因表达又受到诸如基因组 DNA甲基化分布及水平[4]、组蛋白修饰等的协同调控。其中，DNA甲基化是真核生物DNA最常见的复制后调控方式之一。其由DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase，DNMT）起介导作用，以S-腺苷甲硫氨酸（SAM）作为甲基供体，提供硫代蛋氨酸，将甲基转移到其他的化合物上，进而随着DNA甲基化水平的变化而改变DNA稳定性、构象或染色体结构等，最终达到调控基因表达的目的。此外，Hepburn[5]等指出自交会导致甲基化水平逐步积累，而杂交则能够解除基因组的甲基化修饰。这意味着DNA甲基化、基因表达与杂种优势的表现间存在着一定的内在联系。

为深入了解DNA甲基化在生物体内的调控机制和作用，目前已有多种方法分别从基因到基因组各个层次对之进行研究。其中Reyna-López[6]在1997年报道的甲基化敏感扩增多态性技术（Methylation-Sensitive Amplification Polymorphism，MSAP）由于操作简便、条带具高多态性等优点，而成为检测基因组DNA甲基化水平的有效手段。其原理是通过一对对胞嘧啶甲基化修饰敏感性不同的同裂酶（MspⅠ/Hpa Ⅱ）对基因组进行酶切，通过预扩增、选扩增等多个步骤获得甲基化敏感多态性谱带，而后分析得到组织甲基化水平。目前该技术已被应用于栉孔扇贝（Chlamys farreri）[7]、太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）[8]、尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）[9]、拟南芥（Arabidopsis thaliana）[10]等多个经济物种的基因组DNA甲基化研究中。

马氏珠母贝（Pinctada fucata martensii）又称合浦珠母贝，是中国重要的海水珍珠培育贝类之一。由于长期的近亲繁育、累代养殖以及养殖环境的恶化，导致了珍珠贝出现生长缓慢、性状下降等问题，因此通过选育出具抗逆性、高生长性能的群体是珍珠贝产业可持续发展的主要出路，但选育背后所隐含的分子机制尚未清楚。本研究通过分析马氏珠母贝近交与杂交家系的DNA甲基化水平，同时对部分甲基化修饰片段进行回收、注释，以期探明马氏珠母贝近交家系F1和杂交家系Z1间的DNA甲基化修饰水平和部分具甲基化修饰序列，为马氏珠母贝遗传育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料 实验所用的马氏珠母贝自交和杂交材料构建于2012年4月，采用因子设计构建法，亲本来自于两个全同胞家系（A与B）。A1♀ × A2♂构成近交家系（F1）；A1♀ x B1♂构成杂交家系（Z1）。养殖与管理方法按照常规技术在徐闻县大井村珍珠养殖基地吊养。

在F1和Z1中分别选取20个大小规格较为一致的马氏珠母贝，其中 F1（38.01 ± 7.13）g，Z1（37.52 ± 8.63）g，在清净的海水中暂养2 d后取样。MSAP分析使用闭壳肌组织，固定于体积分数75%的乙醇水溶液，4℃保存备用。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 参照Xiong等[11]和于涛等[7]在玉米、扇贝中等使用的方法分别设计接头引物、预扩增PCR引物、选扩增PCR接头（表1），并在实验过程中分别对酶切、连接、预扩增及选扩增反应的反应体系和条件等进行优化。

1.2.2 提取组织DNA及RNA 使用Thermo Fisher Scientific的 DNA提取试剂盒，参照贝类基因组DNA提取法[12]，分别提取F1、Z1个体闭壳肌组织DNA。挑取高质量的DNA，按照每4个DNA混为一个样的原则，将F1、Z1个体DNA分别混合，而后进行下一步实验操作。

1.2.3 MSAP过程 酶切反应：分别用 EcoRⅠ + MspⅠ、EcoRⅠ + Hpa Ⅱ对同一个DNA样品进行酶切。EcoRⅠ+ MspⅠ反应体系包括0.5 μg DNA，2.5μL CutSmart，1μL EcoRⅠ，1μL MspⅠ，余下体积用灭菌ddH2O补至25μL；EcoRⅠ + Hpa Ⅱ则将上述体系中的MspⅠ替换为Hpa Ⅱ即可。反应条件为37℃金属浴6 h；65℃灭活30min，而后琼脂糖凝胶检测酶切效果。

表1 引物序列Table 1 The Primer sequence

连接反应：取等体积接头引物EcoRⅠ（10 pmol）和MH（100 pmol）充分混合，而后置于94℃变性5min，4℃保存备用。连接体系包括10μL酶切产物，3μL混合的接头引物，8μL SolutionⅠ，4μL ddH2O。反应条件为16℃，12 h。连接产物稀释20倍后4℃保存留待预扩增反应使用。

PCR扩增反应可分为预扩增反应和选扩增反应。其中预扩增反应体系包括5μL连接产物，1μL Pre-EcoRⅠ，1μL Pre-MH，12.5μL PAGE-Mix，5.5μL ddH2O。反应条件为94℃，2min；94℃，30 s；52.5℃，30 s；72℃，1min；合计25个循环，72℃，8min。琼脂糖凝胶检测时，泳道呈现弥散带则表明反应条件合适，将之稀释20倍后4℃保存。

选扩增反应体系与预扩增反应一致，反应条件为94℃，2min；94℃，30 s；65℃，30 s，72℃，1min；合计13个循环；94℃，30 s；56℃，30 s；72℃，1min；合计23个循环；72℃，8min；4℃保存。琼脂糖凝胶检测时见泳道中具多条特异性条带即可使用聚丙烯酰胺凝胶分离选扩增产物。

1.2.4 聚丙烯酰胺凝胶 使用0.06 g/mL的聚丙烯酰胺凝胶分离选扩增产物，根据选扩增产物在泳道上的情况，可将之分为3个不同类型[13]（图1）。Ⅰ型为Hpa Ⅱ和MspⅠ泳道均有带，代表非甲基化（A）；Ⅱ型为Hpa Ⅱ无带，MspⅠ有带，代表全甲基化（B）；Ⅲ型则是Hpa II有带，Msp I无带，代表半甲基化（C）。所有引物扩增条带数（D）：D=A + B + C；组织甲基水平=[（B+C）/D]；全甲基化水平 =（B/D）；半甲基化水平=（C/D）；非甲基化水平 =（A/D）。

各类型及组织甲基化百分比率均用平均值±方差表示；用t-检验进行显著性分析。

1.2.5 对特异性的甲基化修饰片段进行回收、克隆、测序、筛选和比对 回收聚丙烯酰胺凝胶上重复、清晰，且具特异性修饰（全甲基化修饰或半甲基化修饰）位点，分别加入30μL ddH2O，沸水浴20min，吸取上清后辅以相应引物及PCR条件进行PCR扩增。扩增产物再次酶切后，仍为明亮单一条带，则说明 MSAP过程中的酶切反应完全，可用pMD-19T连接，DH5α转化，挑取阳性单克隆菌落送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，而后通过在线Blast网站和本地Blast程序对测序结果进行比对分析。

2 结果

2.1 DNA甲基化修饰水平分析

20对引物扩增的产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，结果显示引物扩增效果好，均能获得谱带清晰且重复、甲基化多态性高的图谱（图1）。

图1 不同个体的选择性扩增产物聚丙烯酰胺凝胶检测Fig.1 Selective amplification products were detected by agarose gel

自交家系F1和杂交家系Z1产生的甲基化数据信息见表2。F1在全甲基化位点数目和组织甲基化总数上显著高于Z1，但二者在半甲基化位点数目和非甲基化位点数目上均没有显著性差异。

表2 甲基化条带数Table 2 The data of DNA methylation

自交家系F1和杂交家系Z1的各类型甲基化位点比例列于表3。F1的全甲基化位点比例和组织甲基化水平均显著高于杂交家系 Z1，但杂交家系 Z1的非甲基化位点比例却显著高于自交家系F1的。自交家系F1和杂交家系Z1在半甲基化位点比例上没有显著差异。

表3 各甲基化类型位点在马氏珠母贝各组织中的比率Table 3 The percentage of DNA methylation type in difference tissues of Pinctada martensii %

2.2 具甲基化修饰片段分析

对回收片段进行连接、转化、测序及序列比对，而后使用在线Blast网站和本地Blast程序进行同源性比对：F1共获得9条具甲基化修饰片段，其中有8条片段能够在马氏珠母贝基因组数据中找到对应全长序列。经Blastn注释为E3泛素连接酶、逆转录病毒多聚蛋白、神经肽受体、交叉结点核酸内切酶、磷酸糖器、苯丙氨酸解氨酶、隐花色素蛋白、脆性位点相关蛋白；Z1共获得5条甲基化修饰片段，均能在马氏珠母贝基因组数据库中找到对应全长序列。经 Blast注释为脆性位点相关蛋白、神经元乙酰胆碱受体α亚基、无调性的同源蛋白、麦芽糖酶、甲基胞嘧啶双加氧酶。结合聚丙烯酰胺凝胶，标出各个片段在 F1、Z1所具有的甲基化类型（表4—5）。

表4 F1回收序列比对结果Table 4 The results of comparison by Transcriptome

表5 Z1回收序列比对结果Table 5 The results of comparison by Transcriptome

结合表 5、图2可发现，尽管Sequence 9和Sequence 10均属于脆性位点相关蛋白，但其在F1和Z1中的片段长度及类型并不一样，F1中为半甲基化，Z1中为全甲基化。

3 讨论

DNA甲基化作为表观遗传的重要组成部分，其在基因印迹[14]、染色体的维持[15]、基因表达[16]等多个生物学过程中发挥着重要作用[17]。Xiong等[11]最早使用MSAP技术分析了水稻的甲基化水平，姜群等[8]通过F-MSAP对太平洋牡蛎的不同组织的甲基化水平进行分析，证明了MSAP检测结果是有效、可靠的。本实验通过MSAP技术分析了马氏珠母贝近交与杂交家系的闭壳肌甲基化水平和模式，近交家系F1的组织甲基化水平显著高于杂交家系Z1，这与栉孔扇贝[7]、肉牛[18]、猪[19]等关于 DNA甲基化与杂交关系的结论相似：杂交子代的甲基化水平低于自交子代。通常认为自交并没有改变甲基化率，但杂交在保持大部分甲基化模式稳定传递的同时，还进行丰富的甲基化和去甲基化变化，并在环境的参与下形成一个综合双亲性状并生存的状态，这正是导致近交、杂交子代的DNA甲基化修饰水平存在差异的主要原因。

研究认为杂交子代所具有的杂种优势可能是组织甲基化水平降低所致[20]。一般来说，杂种优势的形成涉及到大量基因的表达开启或关闭、基因间、基因与环境之间的相互作用，这是一个复杂的调控过程。在这个过程中，并非所有的基因的甲基化状态都发生改变，而是以DNA甲基化为主的协同机制确定最终的基因表达。本研究中，两个家系共比对上14条存在DNA甲基化修饰的基因组序列，可以发现回收序列中有个别序列的甲基化状态并未发生变化，如泛素连接酶、逆转录病毒多聚蛋白等；亦有诸如脆性位点相关蛋白基因，其在自交家系F1中呈现半甲基化修饰，但在Z1中呈现全甲基化修饰，并且其修饰长度亦不同。一般认为杂交是利用现有的基因和性状进行重新组合，将甲基化程度解除或重新编排，而后产生新的基因型和表型[21]；同时，基因的不同甲基化模式是相对应于不同的转录水平和功能[22]，进而使得基因在表达的过程中更加稳定可控。因此，脆性位点相关蛋白DNA在杂交过程中被予以新的甲基化状态，即全甲基化，推测这能够调控基因表达，但这还需要进一步的实验验证。Xiong等[11]认为在产生杂种优势的过程中，某些位点的甲基化修饰降低对杂种优势有利，某些位点的甲基化修饰增强对杂种优势亦有利。熊立仲等[23]利用一套双列杂交组合的剑叶进行研究，也得到相同的结论。可见，DNA甲基化与杂种优势并非是单一的线性关系，可能还有其他的表观遗传修饰的协调表达，因此还需要结合遗传基础、基因表达调节等学科知识方能最终揭示杂种优势的生物学基础。

据报道，水产动物的DNA甲基化水平通常在20%～50%左右。尼罗罗非鱼[9]为23.74%；背角无齿蚌[24]鳃组织为 47.9%，唇瓣为 35.5%，闭壳肌为50%，外套膜为 46.3%；栉孔扇贝、海湾扇贝、虾夷扇贝、虾夷扇贝海大金贝[25]分别为 32.08%、25.99%、32.88%和 34.97%等。但本实验结果显示F1、Z1的组织甲基化水平远低于平均，这可能与物种或组织特异性、年龄、环境差异等有关。同时，由于 F1、Z1的全甲基化水平显著高于半甲基化水平，因此可以判定F1、Z1的甲基化模式主要是CpG型，这与目前多数水产动物的研究结果类似。

目前，关于杂种优势的分子机制尚未透彻，不能判定马氏珠母贝的DNA甲基化水平降低就必然产生杂种优势，它们之间的关系需要将来更多的结果来佐证。

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（责任编辑：陈庄）

Comparison of DNA Methylation Polymorphisms BetweenⅠnbred and Hybrid Families of Pinctada fucata martensii

LUO Shao-jie1，ZHANG Peng-fei1，JⅠAO Yu1，WANG Qing-heng1,2，DU Xiao-dong1,2,DENG Yue-wen1,2
（1.Fisheries College,Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524088,China; 2.Guangdong Technology Research Center for Pearl Aquaculture and Process,Zhanjiang 524025,China）

Methylation-sensitive amplification polymorphism（MSAP）technology was used to analyze the methylation levels of adductor muscle from the inbred family（F1）and the hybrid family（Z1）of Pinctada fucata martensii.Meanwhile，specific methylation fragments were extracted，sequenced and annotated.The results showed that，（1）（632.2 ± 22.58）and（588.60 ± 25.09）clear and repetitive DNA bands were obtained by using 20 pairs of primers from F1and Z1，respectively.The percentages of methylation levels were（9.93 ± 1.60）% in F1and（8.04 ± 1.25）% in Z1（P＜0.05）.（2）After the specific bands had been extracted and sequenced,nine methylation fragments were obtained from F1,including eight annotated sequences,such as E3 ubiquitin-protein,Retrovirus polyprotein,Neuropeptide F receptor,Crossover junction endonuclease,Sugar phosphate exchanger,Phenylalanine ammonia-lyase,Cryptochrome and Fragile site-associated protein in F1.And five methylation fragments was obtained from Z1，and were annotated as Fragile site-associated protein,Neuronal acetylcholine receptor,Proteinatonal homolog,Maltase-glucoamylase and Methylcytosine dioxygenase.These results are helpful to elucidate the function of methylation inheterosis,providing the theoretical basis for the aquaculture breeding research in pearl oyster P.fucata martensii.

Pinctada fucata martensii; inbred; hybrid; methylation-sensitive amplification polymorphism

S917.4

A

1673-9159（2016）06-0009-07

10.3969/j.issn.1673-9159.2016.06.002

2016-06-14

国家自然科学基金(31672626)；广东省科技计划（2015A030302079）；广东省海洋渔业局项目（Z2014009）

罗少杰（1991—），男，硕士研究生，研究方向为海洋生物学。E-mail：rogerjoke1@hotmail.com

邓岳文，男，教授，研究方向为贝类遗传育种与养殖。E-mail：dengyuewen@sohu.com; Tel：0759-2383346