响应曲面法分析温度与pH对虎斑乌贼受精卵孵化率的联合效应

吴富华，黄建盛，陈桂鑫，郑雷鸣，徐华当

（广东海洋大学水产学院，广东 湛江 524088）

响应曲面法分析温度与pH对虎斑乌贼受精卵孵化率的联合效应

吴富华，黄建盛，陈桂鑫，郑雷鸣，徐华当

（广东海洋大学水产学院，广东 湛江 524088）

为探讨虎斑乌贼受精卵最佳孵化条件，根据中心复合试验设计，在单因子试验基础上，用响应曲面法分析温度（24～32℃）与pH（7.0～8.5）对受精卵孵化率的联合效应，获得温度与pH的最佳组合。结果表明：在本试验条件下，温度和pH的一次、二次效应及两者的互作效应对孵化率影响均有统计学意义（P＜0.01）；随着温度或pH的上升，孵化率呈先升后降的变化趋势，对数据进行二次多元回归拟合，得孵化率（Y）对实际自变量温度（X1）和pH（X2）的二次回归方程 Ŷ=85.27 - 6.74 X1+ 5.22 X2+ 9.42 X12-12.43 X12- 8.18 X22，回归方程的相关指数为0.978 6，校正系数为0.963 3，精密度达22.974，可用于预测与分析。回归方程优化显示，温度为27.5℃和pH 7.9时，孵化率最大值为86.46%，模型的可信度高达0.949。验证结果表明，该组合条件与预测值相符。

虎斑乌贼；温度；pH；孵化率；响应曲面

虎斑乌贼（Sepia pharaonis）个体大，肉细嫩，味道鲜美，营养丰富，是重要的近岸水产经济动物。人工种苗培育是发展虎斑乌贼人工养殖的关键。近年来，学者对虎斑乌贼的养殖模式[1]、不同时期骨板生长变化[2]、胚胎耗氧率[3]、视叶谷氨酸表达[4]、胚胎毒性[5]等均有研究。关于生态因子对虎斑乌贼受精卵孵化的影响，刘建勇等[6]认为其最适孵化温度范围为24～30℃，黄建盛等研究表明，其适宜孵化盐度为27.0～33.0[7]，经中心复合试验设计及响应曲面法分析，认为在温度26～28℃、盐度29～31条件下进行孵化可提高生产效率[8]。

水生动物胚胎发育过程发生的一系列生理、生化反应通常需要在适宜的外界环境条件下进行。水体中的温度、盐度、pH、溶解氧及光照等生态因子对胚胎发育的正常发育和是否成功孵化至关重要。温度对受精卵孵化的影响主要表现为对孵化酶活性的影响[9]，通常是高于适宜温度会造成酶活性破坏，低于则抑制酶活性。pH是养殖水质检测的重要指标之一，直接对海洋生物的代谢机能影响，还能通过影响水体的其他理化因子，间接影响海洋生物的生长发育[3]。关于温度与 pH对虎斑乌贼受精卵孵化率是否存在交互作用尚未见有报道。本研究中拟通过建立温度、pH与孵化率之间的回归模型，研究温度与pH对虎斑乌贼受精卵孵化率的一次、二次及互作效应，并通过优化分析找到温度与 pH的最佳组合，旨在优化孵化条件，建立更为合理与高效的孵化技术体系，为完善其人工孵化技术工艺提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

虎斑乌贼亲体来源于2014年3月湛江沿海海域捕获的野生群体，挑选性腺成熟的亲体饲养在湛江硇洲岛海上网箱，表层水温24～27℃，盐度27～30，pH 7.7～8.1，DO≥6mg/L。每天投喂1次冰鲜杂鱼，在网箱饲养条件下亲体自然产卵。当日产出的受精卵用薄膜袋充氧运输回广东海洋大学鱼类增养殖实验室，挑选处于原肠后期的发育正常的受精卵用于实验。

1.2 试验设计与分组

在实验设计前先进行温度与pH的单因子预实验，获得虎斑乌贼受精卵适宜的温度和pH范围。根据预实验结果采取中心复合试验设计和二因素五水平的响应曲面分析方法，因子为温度（24～32℃）和pH（7.0～8.5），分别以X1和X2表示，响应指标为孵化率，以Y表示。试验设计见表1，共13个试验点，其中8个为析因点，5个为中心点，中心点重复5次，以估计误差[10]。次序随机，每个试验组合设置3个平行组。

1.3 试验方法

试验在39只装有30 L过滤自然海水的塑料桶中进行。用1 mol/L的氢氧化钠或盐酸调pH分别为7.0、7.2、7.8、8.3及8.5，曝气3 d待用。用电子恒温棒（AT-350W，创星电器有限公司）和冰袋调温度分别为 24.0、25.2、28.0、30.8、32.0℃，温差±0.1℃，用pH计（PHS-3C型，上海精密仪器仪表有限公司）测定pH。

将受精卵放入直径30cm、高10cm塑料篮，每篮100粒，悬浮于塑料桶中孵化。孵化过程中连续充气，溶氧保持在5mg/L以上，自然光周期，水体盐度30，每天换水50%，换水前后温差±0.5℃。每天观察胚胎发育，记录每桶孵出幼体数。以各组最后1粒卵孵化后7 d内不再有幼体孵出为试验结束时间[11]。

2015年3月和4月分别在同一地方获得虎斑乌贼受精卵，在最优温度–pH组合条件下进行孵化验证试验，孵化方法同上，设置5个重复组。

1.4 响应值测定

响应值即孵化率，是指孵出幼体数与受精卵总数的比值。

1.5 数据处理

结果用平均值±标准差表示。通过最小二乘法拟合因子与响应值之间的二次多项回归方程为：

式中，Ŷ为响应预测，在此响应为孵化率；b0为回归系数，b1为温度的一次效应，b2为 pH的一次效应，b3为温度与pH联合效应，b4为温度的二次效应，b5为pH的二次效应。

试验设计、数据分析和模型建立采用软件Design Expert（8.0v），并通过软件进行回归方程解析以及响应曲面分析，获得最佳温度、pH组合。显著水平为0.05，极显著水平为0.01。

2 结果与分析

2.1 温度与pH对虎斑乌贼受精卵孵化率的影响

温度与pH对虎斑乌贼受精卵孵化率的影响结果见表1。利用Design-Expert软件对表1数据进行多元回归拟合，得到二次方程的响应曲面及其等高线（图1）。由图1及表1可知，随着温度或pH的上升，虎斑乌贼受精卵孵化率呈先上升后下降的变化趋势，在温度24～28℃和pH 7.0～7.8范围内呈上升变化，温度28～32℃和pH 7.8～8.5范围内则呈下降趋势。在本研究条件下，响应曲面形状较陡，等高线形状为椭圆形，说明温度、pH对虎斑乌贼受精卵孵化率有显著影响，两因子的交互作用对孵化率有显著影响。

2.2 模型的建立及其显著性检验

表 1数据经回归拟合，得孵化率（Y）与温度（X1）、pH（X2）间的二次多项回归模型为

方程的相关指数R2=0.978 6，校正系数 R2adj=0.963 3，说明模型可解释97.86%的响应值变化，仅总变异 2.14%不能解释；精密度 (Adeq precision)是有效信号与噪声的比值，大于4.0视为合理，模型中精密度达22.974，说明模型拟合程度良好。

表1 温度与pH的试验设计及结果Table1 Experimental design of temperature and pH combinations and results (Mean±SD)

图1 温度与pH及其交互作用对虎斑乌贼受精卵孵化率影响的响应曲面和等高线Fig.1 Response of surface plot and its contour plot of the effects of temperature and pH and their mutual interactions on hatchability of Sepia pharaonis embryos

上述回归模型显著性检验结果（表2）表明，F=63.98，P=0.0001＜0.01，说明回归模型极显著；失拟项F=1.13，P=0.437 6＞0.05，说明所建模型有效。因此，可用该模型分析和预测温度与pH对虎斑乌贼受精卵孵化率影响。模型系数的显著性检验结果（表3）表明，模型95%置信区间的截距编码值局限均大于零，说明所建模型有意义；温度的一次、二次效应及pH的一次、二次效应均对孵化率影响有统计学意义（P＜0.01），温度与pH的联合效应对孵化率影响也有统计学意义（P＜0.01）。

表2 温度与pH对虎斑乌贼受精卵孵化率的回归模型方差分析Table 2 Analysis of variance for the effect of temperature and pH on hatchability of S.pharaonis embryos

表3 温度与pH对虎斑乌贼受精卵孵化率的模型回归方程系数显著性检验Table 3 Test of significance for regression coefficient of model of temperature (X1) and pH (X2) on hatchability of S.pharaonis embryos

2.3 模型优化

根据 Deniz的方法[13]对虎斑乌贼受精卵孵化率的回归模型进行优化，结果显示，孵化率估计最优预测的95%置信区间下限为83.65，上限为89.27，获得温度和pH最优组合为27.5℃和pH 7.9，在此最优条件下，孵化率为86.46%，可信度达到0.949。

2.4 模型验证

以27.5℃和pH 7.9为条件的验证结果见表4。由表4可知，2批次受精卵孵化率均接近预测数据，认为响应曲面获得的最优组合数据可靠。

表4 结果验证Table 4 Results of demonstration test

3 讨 论

3.1 温度对虎斑乌贼受精卵孵化影响

温度是影响受精卵孵化的重要因素之一。蒋霞敏等[11]研究表明，拟目乌贼（Sepia lycidas）胚胎发育适宜温度为21～30℃，最适温度为24℃，温度对拟目乌贼胚胎发育影响显著（P＜0.05）；刘建勇等[6]研究表明，虎斑乌贼胚胎发育最适温度为24～30℃；本研究发现，在盐度30、温度24～28℃条件下，虎斑乌贼受精卵孵化率随温度升高而上升，当温度高于28℃时，孵化率呈下降趋势。这可能与温度影响孵化酶活性有关。在适宜温度条件下，受精卵孵化酶活性较高，细胞内各种生化反应和代谢效率高[14]，因此，孵化速度较快，孵化率较高；但高温可能抑制孵化酶的活性，长时间的高温使胚胎内积累的能量过早消耗[15]，导致胚胎无法破膜而出，孵化率降低。王鹏帅等[3]测定不同温度下虎斑乌贼受精卵期、原肠胚期、器官形成期和内骨骼出现期耗氧率，发现水温27℃时耗氧率有高峰值，而胚胎耗氧率通常在最适宜温度条件下达到峰值。黄建盛等[8]采用中心复合试验设计及响应曲面法获得影响其孵化率最佳温度和盐度最优组合为 27.6℃和31.1，结合本研究结果，认为虎斑乌贼受精卵孵化最适温度为27～28℃。

3.2 pH对虎斑乌贼受精卵孵化影响

虎斑乌贼属于卵生水生动物，其受精卵孵化过程受水体pH影响，卵膜对pH有一定调节能力，在一定范围内，不会对胚胎发育造成显著影响。王鹏帅等[3]测定不同水体 pH条件虎斑乌贼胚胎受精卵期、原肠胚期、器官形成期和内骨骼出现期等 4个发育时期的耗氧率，发现pH在7.0～9.0时的耗氧率差异不显著，认为虎斑乌贼胚胎对水体pH的调节能力较强。本研究表明，pH 7.0～7.8时孵化率上升，pH 7.8～8.5时则下降，方差分析表明，pH的一次、二次效应对孵化率影响均有统计学意义（P＜ 0.01），推测其原因是pH变化虽不影响胚胎的新陈代谢，但会影响孵化酶活性，或改变酶与底物的结合，从而影响孵化率，具体原因有待进一步研究。

3.3 温度与pH对虎斑乌贼受精卵孵化的联合效应

生态因子对头足类胚胎发育有重要影响[12,16]，更应关注各生态因子对孵化的交互作用[8]。本研究考察温度与水体pH对虎斑乌贼受精卵孵化率的交互作用，发现两者间存在显著的联合效应（P ＜0.05）。近年来，生态因子联合效应对水产经济动物生长发育影响研究越来越受到重视。如在尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）生长及抗氧化酶活力[17]、尼罗罗非鱼饲料利用率[18]、大菱鲆(Scophthalmus maximus)饲料转化率[19]、菲律宾蛤（Ruditapes philippinarum）仔稚贝生长环境条件[20]、马氏珠母贝（Pinctada martensii）受精率及孵化率[21]、尼罗罗非鱼性别分化[22]等领域均有发现生态因子之间存在联合效应。Montgomery[23]明确指出，联合效应比单纯主效应更重要，更具有实际意义。

响应曲面法可研究因子与响应值之间、因子与因子之间的相互关系，并优化得最佳因子组合[10]。本研究采用响应曲面法建立温度与pH对孵化率的连续变量曲面模型，回归模型均极显著（P＜0.01），回归方程决定系数高，失拟项检验结果不显著（P＞0.05），模型中各项效应的估算可靠，说明所建模型有意义，可用于分析与预测。优化得影响孵化率最佳温度和pH最优组合27.5℃、7.9，最优孵化率为86.46%，可信度达 0.949。验证试验结果与预测相近，证明所构建模型可靠。

胚胎孵化前须达到特定发育阶段方可进入孵化进程，然而，仅具备完全成熟的孵化腺细胞并不足以引起孵化，因为完全发育的胚胎须受内部或外部刺激后方分泌孵化酶[24]。提高虎斑乌贼人工种苗培育效果，还需进一步系统研究水体溶解氧、光照、氨氮等生态因子影响及因子间联合影响，以便建立更为合理与高效的孵化技术体系。

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（责任编辑：刘庆颖）

Combined Effects of Temperature and pH on Hatchability of Fertilized Egg of Sepia pharaonis by Using Response Surface Method

WU Fu-hua,HUANG Jian-sheng,CHEN Gui-xin,ZHENG Lei-ming,XUN Hua-dang
（Fisheries College,Guangdong Ocean University,Zhanjiang,524088,China）

On the basis of one-factor tests and the central composite design (CCD) principle,the method of response surface analysis was adopted to evaluate the combined effects of temperature (24–32℃) and pH (7.0–8.5) on hatchability of Sepia pharaonis.The results showed that the linear and quadratic effects of temperature and pH had a very significant effect on hatchability (P＜0.01).The interactive effect between temperature and pH also had a very significant effect (P＜0.01).Hatchability increased and then decreased as the temperature or pH increased.The model equation of hatchability (Y) towards temperature(X1) and pH (X2) were established as follows:Ŷ=85.27–6.74 X1+ 5.22 X2+ 9.42 X12–12.43 X12–8.18 X22(R2=0.978 6; adjusted R2=0.963 3; Adeq precision=22.974).The experimental results indicated that the proposed model was reasonably accurate and can be used for describing and predicting the hatchability.Solving the regression equation for temperature equals to 27.5℃ and pH equals to 7.9,the optimum predicted value for hatchability was 86.46% and the reliability peaked to 0.949.Moreover,since verification result of optimum conditions accorded with the predicted value,it is suggested that the hatching of fertilized egg of S.pharaonis can be improved by rearing at an optimal combination of temperature and pH.

Sepia pharaonis; temperature; pH; hatchability; response surface

S968.3

A

1673-9159（2016）06-0028-05

10.3969/j.issn.1673-9159.2016.06.005

2016-05-30

广东海洋大学大学生创新创业训练计划项目（CXXL2014010）

吴富华（1992－），男，研究方向为水产经济动物养殖。Email：461416433@qq.com

黄建盛，博士，讲师，研究方向为水产经济动物养殖生理生态学。Email：huangjs@gdou.edu.cn