Treg/Th17细胞失衡对尿毒症血液透析患者微炎症因子及血管钙化的影响

王莉华 侯晶晶 高永宁 王丽丽 申 磊

(河北医科大学第二医院血液透析科，河北 石家庄 050000)



Treg/Th17细胞失衡对尿毒症血液透析患者微炎症因子及血管钙化的影响

王莉华 侯晶晶 高永宁 王丽丽 申 磊

(河北医科大学第二医院血液透析科，河北 石家庄 050000)

目的 探讨尿毒症患者血液透析调节性T细胞(Treg)与辅助性T 细胞17(Th17)水平失衡对相关炎症因子及血管钙化因子的影响。方法 105例尿毒症患者为受试对象，其中35例尿毒症合并心血管病行血液透析的患者为观察1组，33例尿毒症行血液透析无心血管病的患者为观察2组，37例尿毒症无心血管病未行血液透析的患者为对照1组，另选取同期的30例正常健康体检者作为对照2组。以流式细胞技术对单个核细胞中Treg、Th17细胞水平进行检测，酶联免疫吸附法(ELISA)对单个核细胞上清液中白细胞介素(IL)-10、IL-6、IL-17等炎症因子及血管钙化因子中的骨形态发生蛋白-2(BMP-2)进行监测，实时荧光定量(PCR)法检测叉头蛋白p3(Foxp3)、维甲酸相关孤独受体γt信使RNA(ROR-γt mRNA)的表达。结果 观察1组与对照2组相比，存在Treg/Th17细胞比例失衡、BMP-2异常分泌，主要表现为IL-6、IL-17水平和Foxp3、ROR-γt相对表达量升高，而IL-10水平、Foxp3/ROR-γt相对表达量降低(P<0.01)；同时，这一失衡在观察1组、观察2组及对照组1组中均存在(P<0.01)。结论 Treg/Th17细胞比例失衡将引起尿毒症血液透析患者微炎症因子水平异常，导致血管钙化加剧。

调节性T细胞；辅助性T细胞；尿毒症；血液透析；微炎症因子；血管钙化因子

血液透析作为确保尿毒症患者生存时间的重要治疗措施，不仅能有效清除患者体内毒素，还能有效控制并缓解尿毒症相关并发症，但其治疗局限性仍不容忽视。既往资料显示尿毒症患者较正常人的生存质量明显较低，即使在血液透析治疗后仍存在较高的并发症发生率和死亡率〔1〕。微炎症状态时体循环中炎性蛋白和细胞因子水平轻度增高，是导致机体并发症慢性、低强度进展的一种非显性炎性状态，这种状态在临床上并无显著性表现〔2〕。调节性T细胞(Treg)、辅助性T 细胞17(Th17)分别是比较重要的抗炎性细胞、促炎性细胞，Treg/Th17细胞比例失衡在心血管病、动脉粥样硬化中有促进作用。血管钙化是导致尿毒症患者死亡的重要病理改变，同时也在血液透析患者致死和预后中作为独立危险因素而存在〔3〕。本研究针对尿毒症血液透析患者进行研究，旨在分析Treg/Th17水平失衡对相关炎症因子及血管钙化因子的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料 将我院2013年1月至2015年5月收治的尿毒症患者105例选为研究对象，全部尿毒症患者均稳定规律地接受透析治疗，排除免疫性病变、进展型肝病、恶性肿瘤、肝炎，且心瓣膜病变、血栓栓塞、弥散性血管凝血等患者和装心脏起搏器者〔4〕。将其中尿毒症合并心血管病行血液透析的35例患者分为观察1组，尿毒症行血液透析无心血管病的33例患者为观察2组，尿毒症无心血管病未行血液透析的37例患者为对照1组，另选取同期的正常健康体检者30例作为对照2组。观察1组男23例，女12例，平均年龄(56.4±9.2)岁；平均透析时间(29.8±19.2)个月，合并左室肥厚11例、不稳定心绞痛5例、充血性心衰7例、心律失常14例。观察2组男21例，女12例，平均年龄(48.5±10.1)岁；平均透析时间(30.1±16.5)个月。对照1组男24例，女13例，平均年龄(49.7±11.5)岁。对照2组男16例，女14例，平均年龄(48.6±10.6)岁。所有患者性别、平均年龄等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。所有受试者均对本研究知情，自愿参与并签署知情同意书。

1.2 血液透析方案 患者上肢动静脉内瘘行透析，血流量控制在200～250 ml/min，每次时间4～5 h，每周视病情透析2～3次，透析治疗时间至少3个月。应用聚砜膜透析器、碳酸氢盐透析液，设置流量为500 ml/min。

1.3 方法

1.3.1 血液标本采集与外周血单个核细胞分离 于患者入院清晨取空腹肘前静脉血约20 ml装入肝素抗凝试管内，对白蛋白、血红蛋白、血脂以及肾功能等指标进行检测。Ficoll淋巴细胞分离液密度梯度离心将外周血中单个核细胞分离开来，以1640培养液配制为细胞悬液，浓度调整至3×106/ml，后取其上清液于零下80℃条件保存备用。

1.3.2 Treg、Th17水平检测 ①检测Treg时，将CD4抗体和CD25抗体对细胞表面染色后，加入叉头蛋白p3(Foxp3)抗体进行检测，经磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后再加PBS 200 μl重悬，完成后应用流式细胞仪进行分析。②检测Th17时，在单个核细胞中加入CD4单抗置于4℃条件下培养20 min，根据操作说明进行固定、透化处理后加入白细胞介素(IL)-17单抗进行检测。同时设置同型对照确保抗体特异性和有效补充。

1.3.3 IL-10、IL-6、IL-17、骨形态发生蛋白(BMP)-2的检测 采用ELISA法对提取的单个核细胞上清液中IL-10、IL-6、IL-17等炎症因子及血管钙化因子中的BMP-2进行监测，检测试剂盒均由美国RD公司提供，所有试剂批内分析、批间分析的变异系数均低于10%，所有样本设置3个复孔。

1.3.4 Foxp3、维甲酸相关孤独受体γt(ROR-γt)mRNA的检测 实时荧光定量(PCR)法检测Foxp3、ROR-γt mRNA表达，根据说明书应用Trizol提取液(TaKaRa公司提供)提取总RNA，再通过逆转录试剂盒合成cDNA，ROR-γt、Foxp3引物均由上海生工提供。PCR扩增条件参数：94℃变性4 min，35个循环94℃变性20 s，60℃退火30 s、70℃延伸30 s，72℃时检测相关信号。Foxp3、ROR-γt mRNA均采用相对比值表示。

1.4 统计学方法 应用SPSS18.0软件行t检验。

2 结 果

2.1 各组患者Treg、Th17水平比较 Treg水平由高到低依次为观察2组〔(6.05±1.77)〕、对照1组〔(5.93±3.28)%〕、观察1组〔(5.06±2.39)%〕、对照2组〔(0.31±0.42)%〕，组间比较具有统计学差异(F=44.03，P<0.01)；Th17水平由高到低依次为观察1组〔(36.32±9.73)%〕、对照1组〔(35.99±8.91)%〕、观察2组〔(19.65±5.99)%〕、对照2组〔(1.13±1.01)%〕，组间比较差异显著(F=162.11，P<0.01)；Treg/Th17由高到低依次为对照2组〔(26.33±2.28)%〕、观察2组〔(21.24±10.26)%〕、对照1组〔(15.36±4.91)%〕、观察1组〔(14.47±8.31)%〕，组间比较有统计学差异意义(F=19.36，P<0.01)。

2.2 各组患者IL-10、IL-6、IL-17、BMP-2水平分析 IL-10水平由高到低依次为对照2组、观察2组、对照1组、观察1组(P<0.01)；IL-6由高到低依次为对照1组、观察1组、观察2组、对照2组(P<0.01)；IL-17由高到低依次为对照1组、观察1组、观察2组、对照2组(P<0.01)；BMP-2由高到低依次为对照1组、观察1组、观察2组、对照2组(P<0.01)。见表1。

表1 各组患者IL-10、IL-6、IL-17、BMP-2水平的比较

与对照2组比较：1)P<0.01；与对照组1组比较：2)P<0.01；与观察2组比较：3)P<0.01,下表同

2.3 各组患者Foxp3、ROR-γt mRNA检测情况分析 Foxp3 mRNA由高到低依次为观察2组、观察1组、对照1组、对照2组(P<0.01)；ROR-γt mRNA由高到低依次为观察1组、对照1组、观察2组、对照2组(P<0.01)；Foxp3/ROR-γt由高到低依次为对照2组、观察2组，观察1组和对照1组相对表达量相当，组间比较有统计学差异意义(P<0.01)。见表2。

表2 各组患者Foxp3、ROR-γt mRNA水平比较

3 讨 论

尿毒症患者即使维持血液透析仍具有较高死亡率，主要是心血管相关并发症所致〔5〕。血管钙化和尿毒症心血管并发症的关系较为密切，是尿毒症患者心血管病致死的重要病理变化，也是尿毒症血液透析患者预后以及死亡的独立危险因素〔6〕。目前认为尿毒症患者可能不仅发生了 Treg/Th17比例失衡，而且同时出现了比例失衡导致的血管钙化。相关研究认为〔7〕，单个核细胞作为重要的一种免疫性活性细胞，在受到刺激活化后能诱导相关非免疫细胞的功能变化，进而出现加速性动脉粥样硬化、心血管疾病等；而经单个核细胞分离得到的Treg和Th17细胞比例失衡在多种感染性疾病、自身免疫性病变和急性冠脉综合征中均有发生发展〔8〕。

本研究发现，尿毒症合并心血管病患者行血液透析期间存在明显的Treg/Th17比例失衡现象，而血液透析有缓解炎症的作用，可帮助改善患者Treg/Th17失衡。Treg与Th17均由相同前体细胞分化而成，但属于两种不同类型的细胞亚群，具有相互拮抗的分化方式、功能〔8〕。Treg细胞特异性表达Foxp3，具有分泌IL-10等抗炎因子发挥抑制炎症、维持免疫耐受的效果〔9〕。Th17作为一种T细胞，具有较为强大的促炎性作用，主要通过分泌细胞因子IL-17等发挥其作用，特异性表达为ROR-γt〔10〕。尿毒症患者普遍存在微炎症反应，IL-17和IL-6水平随着Treg/Th17比例升高而降低，IL-10则随着Treg/Th17比例升高而升高。血液透析能缓解尿毒症病人的微炎症状态，且其疗效较未透析患者更好〔11〕。BMP-2作为血管钙化促动剂，从胚胎的发育开始表达，是血管钙化中关系最密切的一种蛋白〔12〕。研究显示BMP-2注入肌肉组织能导致局部的异位钙化〔13〕。同时，BMP-2也是心脏发育过程中的重要因子，可促使心脏内心肌祖细胞分化为心肌细胞。本研究说明尿毒症患者的BMP-2较正常健康者更高，且随着Treg水平增加而降低，随Th17水平增加而升高。

综上所述，Treg/Th17细胞比例失衡导致尿毒症血液透析患者微炎症因子水平异常，导致血管钙化加剧，为临床治疗尿毒症患者血液透析期间心血管病的发生提供了思路。

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3 李德谦,姚立茹,赵建国,等.高通量血液透析对尿毒症患者瘦素及TNF-α的清除和微炎症状态影响〔J〕.中国中西医结合肾病杂志,2015;16(10):884-6.

4 吴多钢,郑利军,李国芳,等.常规血液透析和维持性血液透析对尿毒症患者心脏结构及功能影响的对比研究〔J〕.现代生物医学进展,2015;15(21):4132-4.

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6 陈 虹,郑 京.维持性血液透析对尿毒症患者白细胞介素-17的影响〔J〕.山西医药杂志(下半月版),2013;42(16):916-7.

7 吴 姝,洪大情,王 芳,等.尿毒症患者血管钙化的相关危险因素分析〔J〕.实用医院临床杂志,2013;10(2):126-8.

8 张圣平,纳 宁,傅 茜,等.肾移植术后慢性排斥患者外周血Th17细胞的表达〔J〕.中山大学学报(医学科学版),2012;33(1):102-6.

9 Gao J,Zhou L,Wei J,etal.Uremia and thrombotic microangiopathy:Conditions that may havethe same manifestation〔J〕.Renal Fail,2013;35(2):286-8.

10 祝清秀,李映东.探讨通淋汤对尿毒症患者血管钙化因子表达及临床疗效影响〔J〕.当代医学,2013;19(35):161-2.

11 袁 波,杨建军,田 媚,等.血液灌流对尿毒症患者微炎症状态和动脉粥样硬化的影响〔J〕.重庆医学,2015;(14):1900-1.

12 宋国巍,王 磊.现有透析疗法对慢性肾衰竭尿毒症患者微炎症状态的影响〔J〕.中国实验诊断学,2015;19(7):1199-200.

13 Danyan C,Xiaolong H,Song L,etal.The effects of rhBMP-2 and Treg/Th17 functional disequilibrium in uremic patients with cardiovascular complication after maintenance hemodialysis〔J〕.Int J Artif Organs,2013;36(7):464-72.

〔2015-12-13修回〕

(编辑 袁左鸣)

王莉华(1973-)，女，硕士，副主任医师，主要从事血液透析研究。

R692.5

A

1005-9202(2016)22-5691-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.22.091