表皮生长因子对牙周成纤维细胞增殖的促进作用

万英明 张玉影 张璐妮 邵 玉 宁明杰 唐 英 姜 畅 齐 玲 于洪泉

(吉林医药学院附属465医院,吉林 吉林 132013)



表皮生长因子对牙周成纤维细胞增殖的促进作用

万英明 张玉影1张璐妮1邵 玉1宁明杰1唐 英1姜 畅1齐 玲1于洪泉2

(吉林医药学院附属465医院,吉林 吉林 132013)

目的 研究表皮生长因子对人牙周成纤维细胞增殖的作用。方法 原代培养人牙周成纤维细胞，MTT法检测表皮生长因子作用后牙周成纤维细胞的增殖情况，ELISA法检测细胞培养上清中细胞周期蛋白cyclinD1的表达。结果 各浓度表皮生长因子均可以促进牙周成纤维细胞的生长，与正常对照组比较，36 h 20 ng/ml 组、72 h 10和20 ng/ml组有统计学差异(P<0.05)；ELISA检测发现细胞培养上清中cyclinD1的表达增加，20 ng/ml组有统计学差异(P<0.05)。结论 表皮生长因子通过上调细胞周期蛋白cyclinD1的表达而促进牙周成纤维细胞的增殖。

牙周萎缩;表皮生长因子;牙周成纤维细胞;cyclinD1

牙周萎缩出现时对患者可产生不同的影响，如影响美观、牙痛、牙齿松动、遇冷热后出现症状等，这些都给患者带来了极大的痛苦。表皮生长因子(EGF)可以促进多种细胞的增殖和抑制细胞凋亡，在组织损伤修复中发挥十分重要的作用〔1～3〕。本研究主要探讨EGF对牙周成纤维细胞生长的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞来源与试剂 人牙周成纤维细胞取自12岁左右因正畸需要拔除的健康前磨牙的龈乳头组织。DMEM培养液购自美国Hyclone公司，0.25%胰酶和小牛血清购自美国Gibco公司，二甲基亚砜(DMSO)购自美国Thermo公司，四甲基偶氮唑(MTT)购自美国Sigma公司，EGF购自英国PeproTech公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养〔4〕取健康12岁左右正畸拔除的前磨牙，置入青、链霉素中清洗3次，再用DMEM培养基冲洗3～5次，将牙根周围组织剪成1 mm×1 mm×1 mm碎块，将组织块平铺于10 cm2培养皿中，加入含20%FBS的DMEM培养液，37℃、5%CO2及饱和湿度条件下进行培养。从第3日起观察是否有细胞长出，弃去坏死和污染组织，每3 d换液1次。待细胞长至80%～90%进行传代培养，第3代后细胞用于后续实验。

1.2.2 MTT实验 以每孔8×103个细胞的密度将牙周成纤维细胞均匀接种于96孔板中，置于37℃、5% CO2及饱和湿度条件下培养过夜。次日加入EGF(浓度分别为0、2.5、5、10、20 ng/ml，基础培养基为含5%小牛血清的DMEM培养液)，每个浓度设5个复孔，分别作用36和72 h。实验终止前4 h每孔加入MTT 20 μl继续孵育，弃上清后每孔加入DMSO 150 μl振荡溶解，在全自动酶标仪上测定各孔490 nm处的吸光度值。

1.2.3 ELISA实验 用2.5、5、10、20 ng/ml的EGF处理牙周成纤维细胞72 h，设空白对照组。实验终止后收集培养上清，与包被液按1∶1比例包被后4℃过夜。封闭1 h，加入cyclin D1抗体(1∶1 000稀释)4℃孵育过夜。次日加入二抗(1∶1 000稀释)37℃下孵育1.5 h。室温避光显色，颜色呈棕黄色变化时终止显色。自动酶标仪492 nm处测定吸光度值。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0软件行t检验。

2 结 果

2.1 EGF对牙周成纤维细胞增殖的影响 2.5、5、10和20 ng/ml的EGF在作用牙周成纤维细胞36和72 h均可以促进细胞增殖，与正常对照组比较，36 h时20 ng/ml EGF组有统计学差异(P<0.05)，72 h时10和20 ng/ml EGF组均有统计学差异(P<0.05)。在牙周成纤维细胞中，EGF作用具有明显的时间-剂量效应。见表1。

2.2 EGF影响牙周成纤维细胞cyclinD1的表达 EGF各浓度组细胞培养上清中cyclinD1蛋白分泌增加，与空白对照组(0.56±0.05)比较，20 ng/ml浓度组(0.76±0.11)有统计学差异(P<0.05)。2.5、5、10 ng/ml组分别为0.58±0.06、0.61±0.03、0.68±0.06。

表1 不同浓度EGF对牙周成纤维细胞增殖的影响±s,n=5)

与0 ng/ml比较:1)P<0.05

3 讨 论

牙周萎缩的发生主要由两种情况引起，一种是生理性萎缩，是由于年龄增长使牙根暴露造成的；另外一种是病理性萎缩，是由于牙周炎症、长期刷牙方法不当等引起〔5〕。牙周萎缩发生时无特殊有效的治疗方法，主要方法是注意口腔卫生及生活习惯、改正不正确的刷牙方法、有较深的楔状缺损按龋齿及牙髓病治疗、牙周外科手术(如侧向龈瓣转移术等)整复〔6〕。但这些方法对于牙周萎缩的治疗不能起到根本性的作用。生长因子是一类能促进局部组织细胞生长的生物活性物质〔7〕，EGF作用于细胞后，与细胞表面的表皮生长因子受体EGFR结合，继而引起EGFR的自身磷酸化，从而启动下游的多种信号转导途径，引起一系列的生物学效应〔8〕。研究表明，EGF可以通过促进细胞增殖和抑制细胞凋亡，从而促进输卵管上皮细胞和舌背黏膜细胞的增殖；也可以促进角膜缘上皮细胞的生长〔9～11〕。EGF还可以通过促进细胞DNA的合成，进而促进视网膜色素上皮细胞的生长〔12〕。EGF单抗也可促进人牙龈上皮细胞的增殖〔13〕。cyclinD1增加可促进细胞的增殖。因此，EGF可能通过增加细胞周期蛋白cyclinD1的表达，从而促进牙周成纤维细胞的增殖，虽然机制还需更多的数据来充实，但这些数据为EGF用于口腔科牙周疾病的治疗提供了可行性。

1 Su C,Fan M,Lu L,etal.Role of epidermal growth factor in pathogenesis of uterine leiomyomas〔J〕.Asian Pac J Trop Med,2015;8(5):378-81.

2 Ramineni SK,Fowler CB,Fisher PD,etal.Effects of epidermal growth factor-loaded mucoadhensive films on wounded oral tissue rafts〔J〕.Biomed Mater,2015;10(1):015026.

3 Fujihara M,Comizzoli P,Keefer CL,etal.Epidermal growth factor(EGF)sustains in vitro primordial follicle viability by enhancing stromal cell proliferation via MAPK and PI3K pathways in the prepubertal,but not adult,cat ovary〔J〕.Biol Reprod,2014;90(4):86.

4 司晓辉,刘 正.人牙周膜成纤维细胞的体外培养及其生物学性状〔J〕.陕西医学杂志,2001;30(4):195-7.

5 张志愿,俞光岩.口腔科学〔M〕.第8版.北京：人民卫生出版社,2013:1.

6 Sahingur SE,Yeudall WA.Chemokine function in periodontal disease and oral cavity cancer〔J〕.Front Immunol,2015;6:214.

7 Kim K,Wu HG,Jeon SR.Epidermal growth factor-induced cell death and radiosensitization in epidermal growth factor receptor-overexpressing cancer cell lines〔J〕.Anticancer Res,2015;35(1):245-53.

8 Bemanian V,Sauer T,Touma J,etal.The epidermal growth factor receptor(EGFR/HER-1)gatekeeper mutation T790M is present in european patients with early breast cancer〔J〕.PLoS One,2015;10(8):e0134398.

9 张军峰,董 伟,佟书娟,等.EGF和TGF-α影响大鼠舌背黏膜上皮细胞周期和凋亡的比较研究〔J〕.中华中医药杂志,2011;26(3):457-60.

10 孙 伟,李喜和,郭继彤,等.表皮生长因子对牛输卵管上皮细胞生长增殖和凋亡的影响〔J〕.华北农学报,2012;27(S1):410-4.

11 侯光辉,江振友,李校坤,等.EGF、bFGF、TGF-β1 对培养鸡角膜缘上皮细胞增殖性的影响〔J〕.中国实用眼科杂志,2002;20(11):868-70.

12 陈 明,吴景天.表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子对人视网膜色素上皮细胞DN A合成的影响〔J〕.中华眼底病杂志,1998;14(2):98-100.

13 吉建新,廖伟娇,邱志辉,等.表皮生长因子单抗对人牙龈上皮细胞增殖的影响〔J〕.上海免疫学杂志,2000;20(6):353-5.

〔2016-03-17修回〕

(编辑 曲 莉)

吉林省科技厅国际合作项目(No.20140414049GH)；吉林省卫生厅项目(No.2014Z104)

齐 玲(1974-)，女，副教授，主要从事药物研发研究。 于洪泉(1974-)，男，副主任医师，主要从事药物研发研究。

万英明(1973-)，女，副主任医师，主要从事口腔修复和正畸研究。

R787

A

1005-9202(2016)22-5524-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.22.013

1 吉林医药学院病理教研室 2 吉林大学第一医院神经外科