胶原诱导性关节炎小鼠Th17细胞及相关信号蛋白的动态变化

王 弥 封桂英 宋鸿儒 邢恩鸿 郭亚春 安 高 赵晓菲

(承德医学院，河北 承德 067000)



胶原诱导性关节炎小鼠Th17细胞及相关信号蛋白的动态变化

王 弥 封桂英 宋鸿儒 邢恩鸿1郭亚春 安 高 赵晓菲

(承德医学院，河北 承德 067000)

目的 研究鸡Ⅱ型胶原蛋白诱导性关节炎(CIA)小鼠淋巴细胞Th17及其转录激活因子STAT3和细胞因子信号蛋白抑制分子SOCS3的动态变化。方法 取168只DBA1/J小鼠随机平均分为模型组和对照组，用制备的Ⅱ型胶原乳剂免疫模型组小鼠，在初次免疫后第7、14、21天及加强免疫后第7、14、35天在无菌条件下取腹股沟淋巴结，应用流式细胞术和Western印迹技术检测各组Th17细胞及STAT3、SOCS3的变化情况。结果 模型组Th17细胞在加强免疫14 d时比正常组明显升高(P<0.05)。模型组STAT3的表达量在初次免疫14 d时比正常组显著升高(P<0.05)；加强免疫14、21 d比正常组显著升高(P<0.05)。模型组SOCS3的表达量在初次免疫14 d时开始上升并持续到加强免疫14 d，与正常组比较具有明显差异(P<0.05)。结论 Th17细胞参与了RA的炎症进展，其主要在CIA小鼠病程进展中期起作用，Th17细胞在CIA小鼠病程中的变化与转录激活因子STAT3和细胞因子信号蛋白抑制分子SOCS3有关。

胶原诱导的关节炎；Th17细胞；STAT3；SOCS3

类风湿关节炎(RA)晚期可因严重骨质破坏而导致关节僵直、畸形、功能障碍。Th17细胞可能参与了关节的炎症反应和关节损伤〔1～3〕；在胶原诱导的小鼠关节炎模型中，抑制Th17细胞，可以降低关节的肿胀度〔4〕，但在RA发病过程中，Th17细胞主要参与RA病程哪个阶段目前报道不一〔5,6〕。本研究旨在观察胶原蛋白诱导型关节炎(CIA)小鼠淋巴细胞Th17细胞及其信号转导与转录激活因子(STAT)3和细胞因子信号蛋白抑制分子(SOCS)3与RA炎症进展关系。

1 材料与方法

1.1 实验试剂及仪器 PMA/Ionomycin mixture、BFA/Monensin mixture(Multisciences)；抗鼠CD3PECy5，抗鼠CD4 FITC，抗鼠CD8PE，干扰素(IFN)-gamma PE，鼠IgG1 Isotype Contol PE，鼠IgG2 FITC(均为eBioscience)；鸡Ⅱ型胶原(Chondrex)；CFA(Sigma)；抗-STAT3抗体，抗-SOCS3抗体(均为Abcam)；β-actin抗体(SANTA CRUZ)；BCA蛋白定量试剂盒，RPMI-1640培养液(Thermo)；SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×)，RIPA裂解液，PMSF(100 μmol/L)，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(碧云天)；FACSCalibur流式细胞仪(BD)。

1.2 雄性DBA1/J小鼠 7～8周龄(上海斯莱克实验动物有限责任公司)，许可证号：SCXK(沪)2012-0002。动物自由饮食，每笼5只，室温(24±1)℃，湿度(55±5)%。

1.3 方法

1.3.1 建立CIA动物模型 在小鼠适应性饲养1 w后，鸡Ⅱ型胶原与弗氏完全佐剂(CFA)等体积混合进行乳化，制成Ⅱ型胶原乳剂，以乳剂滴在水中不分散为成功标准，在无菌条件下，于小鼠尾根部进行多点皮内注射，每只小鼠注射0.1 ml，第21天以相同剂量加强免疫。对照组小鼠按照上述方法注入等量的生理盐水〔7〕。

1.3.2 关节炎症状评分 每天观察测量小鼠足爪关节肿胀情况，用关节炎指数(AI)来衡量足爪肿胀情况，肢体关节肿胀按0～4级评分:0级为无红肿，评0分；1级为趾关节稍肿，评1分；2级为趾关节及足趾关节肿胀，评2分；3级为踝关节以下足爪肿胀，评3分；4级为包括踝关节在内的全部足爪肿胀，评4分。AI值为四肢关节肿胀评分之和，每只小鼠最少为0分，最多为16分，AI值≥4分为造模成功〔8〕。

1.3.3 实验动物分组及取材 168只雄性DBA1/J小鼠随机分为对照组84只(每时间点12只)和模型组84只(每时间点12只)，在无菌条件下分离腹股沟淋巴结，提取淋巴细胞。

1.3.4 流式细胞术检测各时间点Th17细胞数量 制备单个淋巴细胞悬液，用台盼蓝计数活细胞数(应在95%以上)，然后用CD69染色检测，确定淋巴细胞活化程度在90%以上。Th17细胞检测：在单个淋巴细胞悬液中加入PMA/Ionomycin mixture离子霉素工作液，混匀，37℃培养箱中孵育1 h，加入高尔基体阻断剂BFA/Monensin mixture混匀，在37℃培养箱中孵育5 h。设对照管、检测管1、检测管2，每管加入CD4-FITC 1 μl室温避光20 min后于每管中加入100 μl固定液A，室温避光15 min，洗涤后重悬细胞。每管中加入100 μl破膜及溶血液B，同时加入IL-17A抗体，室温避光15 min，洗涤后重悬细胞，上机检测。

1.3.5 Western印迹检测Th17细胞STAT3、SOCS3蛋白的表达 吸出淋巴细胞悬液置于离心管中，PBS 洗涤后加200 μl含蛋白酶抑制剂的裂解液，冰上充分裂解 40 min后，4℃、12 000 r/min离心20 min;吸取上清，用BCA 法测蛋白浓度，煮沸5 min使蛋白变性后进行SDS-PAGE 电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，加入一抗(1∶1 000)4℃过夜，洗膜；加入辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗(1∶3 000)室温孵育1 h，洗膜，ECL显色液曝光显影，用平均灰度值表示蛋白质的表达水平。

1.4 统计学分析 采用SPSS17.0软件行方差分析或t检验。

2 结 果

2.1 小鼠一般情况 模型组小鼠加强免疫后活动和饮食减少，体重下降，尾根部皮肤溃疡，加强免疫后7 d，90%以上模型鼠至少有一只足爪出现红肿出血，足垫增厚，运动受限，加强免疫后14 d，模型组小鼠足爪肿胀度更高，不能负重，体重下降明显；加强免疫后21 d，模型组小鼠足垫依旧增厚，但足爪充血肿胀程度降低，加强免疫35 d，模型组小鼠足爪红肿明显减轻，但足爪出现畸形；模型组小鼠加强免疫前及正常组小鼠无上述改变。

2.2 CIA小鼠Th17细胞及STAT3、SOCS3的动态变化 小鼠初次免疫后7、14、21 d及加强免疫7 d，模型组Th17细胞与正常组相比无统计学差异(P>0.05)；加强免疫14 d，模型组Th17细胞升高，与正常组相比具有明显差异(P<0.05)；加强免疫21、35 d，模型组Th17细胞仍高于正常组，但与正常组相比差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。初次免疫7 d后模型组STAT3的表达量与正常组区别不明显(P>0.05)；初次免疫14 d后模型组STAT3的表达量与正常组相比显著上升(P<0.05)；初次免疫21 d及加强免疫7 d后模型组STAT3的表达下降，与正常组相比差异无统计学意义(P>0.05)；加强免疫14、21 d模型组STAT3的表达上升，与正常组比较区别明显(P<0.05)；加强免疫35 d，模型组STAT3的表达量仍高于正常组，但与正常组相比无统计学差异(P>0.05)，见表2。初次免疫7 d，模型组与正常组SOCS3的表达量无统计学差异(P>0.05)；初次免疫14、21 d及加强免疫7、14 d，模型组SOCS3的表达开始上升，与正常组比较具有明显差异(P<0.05)；加强免疫21、35 d时模型组SOCS3的表达仍高于正常组，但与正常组比较无统计学差异(P>0.05)，见表3。

表1 Th17细胞的动态变化

与模型组比较：1)P<0.05；下表同

表2 STAT3在CIA鼠病程中的动态变化

表3 SOCS3在CIA鼠病程中的动态变化

3 讨 论

RA是一种常见的慢性自身免疫性疾病，CD4+T淋巴细胞亚群平衡紊乱在RA关节局部的炎症发展和全身免疫反应过程中发挥重要作用。Th17细胞是最新发现的一种辅助性T细胞(Th)，参与免疫应答的各个阶段，在RA的发生发展中发挥重要作用〔9,10〕。Th17细胞在RA等自身免疫性疾病中的作用主要是靠其分泌的IL-17实现的，有研究证明，RA患者血清中IL-17的含量随着关节肿胀度的增加而增加〔11〕。IL-17是一种功能强大的促炎性细胞因子，能够刺激滑膜细胞产生基质金属蛋白酶，促进滑膜血管生成血管翳，从而使关节破坏加重，而且其可诱导破骨细胞增生，导致骨质破坏〔12〕。STAT3是Th17细胞关键的转录激活因子，在Th17细胞分化和炎症过程中发挥着重要作用。致炎因子 IL-6通过诱导活化STAT3而激活STAT3信号通路，IL-6与TGF-β共同促使初始T细胞向Th17细胞分化〔13〕，STAT3信号通路能够激活Th17特异性转录子RORγt的表达，诱导Th17 细胞分泌IL-6、IL-17等细胞因子，这些细胞因子继续参与上述过程，使RA炎症反应不断放大〔14〕。SOCS3是Th17细胞的负调控因子，研究发现SOCS3依赖于STAT3 磷酸化，在TGF-β、 IL-6 和 IL-23 同时存在的情况下，SOCS3仍然抑制 Th17 细胞分化，但 SOCS3表达降低时则可诱导 Th17产生，同时出现 STAT3 高磷酸化〔15〕，因此，SOCS3在抑制Th17细胞的过程中具有非常重要的作用。但是目前，Th17细胞在病程的什么阶段起作用报道不一，有研究证明，活动期RA患者Th17细胞及IL-17A水平表达明显高于对照组，而在临床缓解期时虽然IL-17A水平没有差异，但是外周血Th17细胞表达依然高于对照组，Th17细胞仍参与骨质侵蚀〔16〕。

本研究发现，小鼠在初免7、14、21 d及加强免疫7 d的时候，模型组Th17细胞与正常组细胞没差别，可能与SOCS3的表达上升抑制STAT3有关，而且本课题组前期的实验结果也表明此时主要是Th1细胞升高明显〔17〕。加强免疫14 d模型组小鼠的足爪肿胀度达到最高峰，模型组Th17细胞、SOCS3、STAT3均比正常组显著升高，说明Th17细胞参与了小鼠的关节病变，而SOCS3不足以抑制STAT3的表达。加强免疫21、35 d时小鼠足爪肿胀消退，Th17细胞、SOCS3、STAT3下降至正常水平，说明小鼠可能出现CD4+T细胞平衡紊乱,Th17细胞可能不是RA炎症的启动者，但参与了RA炎症的进展。

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〔2016-06-07修回〕

(编辑 郭 菁)

Dynamic changes of Th17 cells and related signaling protein of collagen-induced arthritis mice

WANG Mi,FENG Gui-Ying,SONG Hong-Ru,et al.

Chengde Medical College,Chengde 067000,Hebei,China

Objective To study the dynamic changes of Th17 cells and STAT3,SOCS3 in lymphoglandula of chicken type Ⅱ collagen-induced arthritis (CIA)mice and investigate the relationship between the development of rheumatoid arthritis and the changes of Th17 cells and STAT3,SOCS3.Methods 168 DBA1/J mice were randomly divided into control group(n=12)and CIA group(n=12).They were respectively picked the lymphoglandula under the sterile condition on the initial immunization 7 d,14 d,21 d and 7 d,14,21 d,35 d after booster immunization.Then the dynamic changes of Th17 cells were detected by flow cytometry and STAT3,SOCS3 were detected by Western blot in different periods.Results Compared with the control group,the level of Th17 in the model group was significantly increased on the 14th day after booster immunization (P0.05);The level of STAT3 in the model group was significantly higher than the control group on the 14th days after initial immunization (P<0.05).However,on the 14 days and 21 days after booster immunization,the level of STAT3 was increased obviously than the control group (P<0.05).The level of SOCS3 was increased significantly on the 14th day after initial immunization (P<0.05),and still higher than the control group until to the 14 days after booster immunization (P<0.05).Conclusions The dynamic changes of CD4+Th17 and STAT3,SOCS3 might be associated with the progress of RA.

Collagen-induced arthritis;Th17;STAT3;SOCS3

国家自然科学基金资助项目(81273986)

宋鸿儒(1961-)，男，教授，主要从事中药免疫和感染免疫研究。

王 弥(1990-)，女，硕士，主要从事中药免疫药理学研究。

R593.22；R392.11

A

1005-9202(2016)22-5501-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.22.004

1 承德医学院附属医院