荧光RT-PCR检测与ELISA检测在戊肝临床诊断效果的比较分析

蔡洁新，杨立杰，赵振杰

（1.北京市房山区第一医院检验科，北京102400；2.北京市第一中西医结合医院泌尿外科，北京100026）

·综述·

荧光RT-PCR检测与ELISA检测在戊肝临床诊断效果的比较分析

蔡洁新1，杨立杰2，赵振杰1

（1.北京市房山区第一医院检验科，北京102400；2.北京市第一中西医结合医院泌尿外科，北京100026）

目的 探讨和比较荧光RT-PCR检测与ELISA检测在戊肝临床诊断的效果。方法 从我院健康体检中心2013年1月至2016年1月的50500血清标本中随机选择100份作为研究标本。通过采用酶联免疫法对戊肝抗体的检测，然后再通过荧光RT-PCR检测法进行确诊，观察和比较两组检测方法的检查结果。结果 阳性一致率为55%，阴性一致率为100%，总一致率为75%，Kappa值为0.59（0.4＜Kappa≤0.75），表示两者一致性一般。ELISA阳性检出率为30%，PCR阳性检出率为50%，PCR阳性检出率明显高于ELISA，数据比较差异具有统计学意义，P=0.000＜0.005。结论 荧光RTPCR检测和ELISA检测在戊肝的诊断中都具有一定的检查准确度，同时荧光RT-PCR检测的阳性检出率明显高于ELISA检测。由于ELISA检测容易受到各方面因素的影响而发生漏诊的情况，因此建议对于ELISA检测出现可疑的标本，使用RT-PCR进行确诊，使更具可靠性。

荧光RT-PCR检测； ELISA检测； 戊肝； 临床诊断

戊型肝炎（HE），属于一种非甲非乙型病毒性肝炎，主要由戊型肝炎病毒感染所导致，其发病者不仅仅限于人类，还包括牲畜，传播途径主要有粪、口途径［1-3］。目前，戊型肝炎在世界各国都有发病，主要集中在亚、非、拉等发展中国家，多发于青壮年人群，病死率达到0.1%～4.0%，孕妇病死率甚至高达25%［4-5］。现如今，临床检测戊型肝炎的主要方法包括血清学抗体ELISA、和RT-PCR病原学检测。在本文中主要通过对我院戊型肝炎患者的诊断资料进行回顾性分析，探讨和比较荧光RT-PCR检测与ELISA检测在戊肝临床诊断效果。

材料和方法

1 一般资料

从我院健康体检中心2013年1月至2016年1月的50500血清标本中随机选择100份作为研究标本。

2 研究方法

2.1检测方法 通过采用酶联免疫法对戊肝抗体进行检测，然后再通过荧光RT-PCR检测法进行确诊，对两种方式的检测结果进行对比分析。

2.2检测仪器和试剂 酶联免疫法试剂盒，上海科华试剂盒；Anthos2010酶标仪器设备，北京普朗生产；RNA提取试剂盒，产自QIAGEN公司；实时荧光定量PCR仪器（型号：CFX96Touch，厂家：美国BIO-RAD公司）。

2.3酶联免疫检测法 按照酶联免疫监测的试剂盒说明书对患者的血清标本HEV-IgM抗体进行检测。如果患者Cutoff值比OD值小或者相当OD值，那么应当评定为阳性；如果患者Cutoff值比OD值更大，那么评定为阴性［6］。操作两次，前后两次皆为阳性确诊为阳性，皆为阴性确诊为阴性，两次结果不一致则列为可疑病例。

2.4荧光RT-PCR检测法 首先提取戊肝RNA，在提取的过程中必须按照RNA试剂盒的说明书进行，然后采用荧光RT-PCR检测HEV-RNA［1-2］。

PCR引物设计的原则如下：GC含量范围为30%～80%，不能有6个相同碱基，避免二级结构，在75～200bp范围的产物内进行扩增，保证引物tm值低于探针tm值的百分之十，最后进行序列同源性检验。引物与探针是上海基康生物按照专利CN101122563 A合成。根据专利CN101122563 A的要求，反应体系必须满足以下几点条件：荧光探针设置为150nmol/L；上下游引物分别选择0.4 μmol/L；二硝基酚，量为0.3mmol/L；氯化镁，量为2 5 mmol/L；选择5μL模板，5×Real-Time PCR Buffer 5 μL，ExTaq HS 0.025 U/μL。扩增环境需在94℃的环境中进行预变性2min，一共需要经历45个循环。当CT值＞45，则评定为阳性［7］。

3 统计学处理

对荧光RT-PCR检测与ELISA检测戊肝的一致性进行Kappa检验，在参考值为0～1的范围检验。如果Kappa值为1，则荧光RT-PCR检测与ELISA检测戊肝完全一致；如果Kappa取值范围在0.75～0.99之间，则表示荧光RT-PCR检测与ELISA检测戊肝具有较理想的一致性；如果Kappa取值范围在0.4～0.75之间，则表示荧光RT-PCR检测与ELISA检测戊肝的一致性一般；如果Kappa取值范围在0～0.4之间，则表示荧光RT-PCR检测与ELISA检测戊肝的一致性较差。对荧光RT-PCR检测与ELISA检测戊肝的结果是否存在差异进行卡方检验，当P＜0.05时，数据比较差异具有统计学意义。

结果

1 ELISA检测结果

在100例标本中，ELISA结果阳性30例，阳性检出率为30%，阴性50例，阴性率检出率50%，可疑病例20例。

2 荧光PCR检测结果

在100例标本中，荧光定量PCR结果阳性 55例，阳性检出率为55%，阴性45例，阴性检出率45%。

3 ELISA检测vs荧光PCR检测

ELISA检测和荧光PCR检测都为阳性的结果30例（30%），都为阴性的结果45例（45%），一共有25例检测结果不一致。其中5例（5%）ELISA检测为阴性，荧光PCR检测为阳性；20例（20%）ELISA检测为可疑病例，荧光PCR检测为阳性。

对ELISA和PCR做Kappa检验，评价二者的一致性，得到如下结果：阳性一致率为55%（30/55），阴性一致率为100%（45/45），总一致率为75%（30 +45+0/100），Kappa值为0.59（0.4＜Kappa≤0.75），表示两者一致性一般。

对ELISA和PCR的结果做卡方检验，评价二者的阳性检出率，计算可得：ELISA阳性检出率为30%，PCR阳性检出率为55%，PCR阳性检出率明显高于ELISA，数据比较差异具有统计学意义，P= 0.000＜0.005。

讨论

1 ELISA检测在戊肝诊断中的应用

酶联免疫法（ELISA），又称之为固相酶联免疫法，利用化学反应连接检测对象和酶，然后利用免疫反应结合检测对象和固相载体上的抗原，最后把底物加进去，对其显示的颜色进行观察，并且根据颜色的深浅程度对抗体的水平进行判断。酶联免疫检测法目前在戊肝检测中应用极为广泛，该种方法能够对戊肝病毒进行定性检测，其灵敏度高，特异度高，并且检查成本低廉，无污染［8-9］。根据本文研究结果可见，采用ELISA检测戊肝，其存在20例弱阳性病例，究其原因，通常而言，采用酶联免疫检测法对急性期发病患者的血清抗HEV-IgM抗体进行检测，其抗HEV-IgM抗体明显升高，以此为诊断HEV。然而，该种检测方法受到一些因素的影响：其一，采集血液标本的患者正好处于HEV窗口期，此时病毒尚未阳转；其二，在发病早期抗HEV-IgM抗体较低，患者对该种病毒不产生应答。上述的情况是导致HEV病毒感染血清标志物显示为阴性的重要原因，容易导致漏诊的发生。

2 抗原RT-PCR检测在戊肝诊断中的应用

因为感染个体HEV的含量并不是无限的，所以，可以通过对靶病毒进行扩增来进行检测。抗原RT-PCR因此被广泛应用于检测戊肝抗原病毒。戊肝病原定性检测主要用在确诊HEV感染的过程中，需要使用兼并引物，并且需要根据毒株的保守序列对引物进行设计引物，从而实现RT-PCR的扩增目的［10-12］。根据本文研究结果荧光定量PCR结果阳性55例，阳性检出率为55%，阴性45例，阴性检出率45%，可疑病例为0。可见，采用荧光定量RTPCR检测技术对戊型肝炎病毒进行检测，不仅具有较高的准确度，而且检出迅速，灵敏度高，重复性良好，有利于在戊型肝炎病毒感染早期进行快速诊 断［13-14］。

3 比较RT-PCR检测与ELISA检测在戊肝诊断中的应用

根据本文研究可知，Kappa值为0.59（0.4＜Kappa≤0.75），这两种方法在检测戊肝方面一致性一般；同时，与 ELISA检测对比，PCR阳性检出率明显更高（P=0.000）。究其原因，对于戊肝多采用ELISA检测血清中抗HEV-IgM，因为不同生产产家使用的试剂盒有所区别，因此检出率存在一定的差异，这是导致漏检发生的原因之一。除此之外，采用酶联免疫检测法检测HEV感染会受到一些因素的限制，例如诊断抗原包含的抗原表位数量较少等，这些因素会对ELISA检测的灵敏度和特异度造成不良的影响。而采用实时荧光定量PCR检测则具有高灵敏度和特异度的优点，并且检出速度快，具有良好的重复性［15］。

综上所述，荧光RT-PCR检测和ELISA检测在戊肝的诊断中都具有一定的检查准确度，同时荧光RT-PCR检测的阳性检出率明显高于ELISA检测。由于ELISA检测容易受到各方面因素的影响而发生漏诊的情况，因此建议对于ELISA检测出现可疑的标本，使用RT-PCR进行确诊，更具可靠度。

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（潘子昂编辑）

Comparative Analysis of RT-PCR and ELISA Detection in
Clinical Diagnosis of Hepatitis E

CAI Jie-xin，YANG Li-jie，ZHAO Zhen-jie
（Clinical Laboratory，the First Hospital of Beijing Fangshan，Beijing 102400，China）

Objective To explore and compare RT-PCR and ELISA detection on hepatitis E and clinical diagnostic value.Methods A total of 100 samples were randomly selected from 50500 serum samples in our hospital from January 2013 to January 2016.Samples were tested by ELISA，and then by RT-PCR.Results Were compared between the two groups.The positive agreement rate was 55%and negative agreement rate was 100%.The total agreement rate was 80%.Kappa value was 0.87（0.75＜kappa is less than or equal to 0.99），and the correlation between two was slightly above average.The positive rate of ELISA was 30%，the positive rate of PCR was 50%，the positive rate of ELISA was significantly higher than that of PCR，the difference was statistically significant，P=0.000＜0.005.Conclusion RT-PCR and ELISA in the diagnosis of hepatitis E show equally specific.RT-PCR has higher positive rate than that of ELISA.It is recommended that ELISA can be used as first choice of screeningof suspicious specimens，RT-PCR can be added as aconfirmation of the diagnosis.

RT-PCR fluorescence detection； ELISA detection； Hepatitis； Clinical diagnosis

10.11748/bjmy.issn.1006-1703.2016.09.030

2016-05-16；

2016-06-02