以草莓花药培养实现脱毒的研究进展

2016-12-17陈玉波张学明姚环宇郑亚杰

北方果树 2016年6期

陈玉波，张学明，姚环宇，郑亚杰

（吉林省农业科学院果树所，吉林公主岭 136100）

1 草莓脱毒植株培育的发展现状及意义

草莓病毒病是草莓生产的主要病害，一般可造成20%～30%的减产，甚至50%以上。侵染草莓的病毒种类多达60种以上，其中草莓斑驳病毒（Strawberry mottle virus，SMoV）、草莓轻型黄边病毒（Strawberry mild yellow edge virus，SMYEV）、草莓镶脉病毒（Strawberry vein band virus，SVBV）和草莓皱缩病毒（Strawberry crinkle virus，SCrV）是我国侵染草莓的4种主要病毒，总侵染率为80.2%，其中单病毒的侵染率达41.6%，两种以上病毒的复合侵染率达38.6%[1]。由于病毒病的危害，植株生长衰弱，结果期推迟，产量减少，果品质量明显降低，造成巨大的经济损失。因此应用脱毒苗进行草莓生产势在必行。

组培脱毒主要包括茎尖培养脱毒和花药培养脱毒。1952年Morel首先利用茎尖分生组织培养获得大丽菊无病毒植株[2]，同时建立了茎尖培养脱毒的技术体系。基于此，茎尖脱毒培养在20世纪60年代得到研究和应用[3～5]。在草莓生产上，1962年Miller首先用茎尖培养方法脱除SMYEV、SCrV、SVBV[6]。茎尖培养脱毒技术的脱毒效果与茎尖大小密切相关。庄子孝一通过实验证明，以茎尖培养脱除草莓病毒，茎尖应为0.3～0.5mm，含一个叶原基较好[7]。高庆玉（1993）通过接种不同大小的茎尖，认为茎尖越小脱毒效果越好，但成活率低[8]。重复切取茎尖也是获取无病毒苗、提高脱毒效果的一种手段。实验证明，重复切取茎尖次数越多，脱毒效果越好，但所需时间较长，工作效率低[9]。

1974年大泽胜次通过花药培养获得再生植株，经鉴定证明，再生植株为脱毒植株，脱毒率为100%[10]。此后，草莓花药培养作为脱毒手段有了一定的研究进展。宫崎正则等对草莓花药培养的脱毒率进行了研究，品种‘America’的脱毒率达 50%～81%，品种‘Empire’的脱毒率达到100%[11]。在我国，1988年覃兰英等最早利用花药愈伤组织诱导再生植株的方法，培育了‘春香’‘宝交早生’‘达娜’等品种的花药脱毒苗[12]。薛光荣用指示植物对 ‘沙尔普斯’‘红岗利德’‘宝交早生’‘春香’‘索非亚’5个品种的花药培养植株进行了病毒鉴定，检测结果表明，不带SMYEV、SVBV、SCrV、SMoV 4种主要病毒，证明为无病毒植株。再生植株在长势、结果性、可溶性固形物含量等方面均超过对照株，果实总产量和平均果重增长幅度分别为21.2%和44.9%[13]。高庆玉通过花药培养所获得的植株脱毒率为100%，而幼叶和茎尖培养所获得的植株脱毒率仅为20%，因此认为花药培养是获得无病毒植株的最好途径[8]。

2 影响草莓花药培养效果的各种因素

2.1 供试材料的基因型、生理状态和发育时期

不同草莓基因型花药再生能力不同。侯喜林对‘女峰’等4个草莓品种进行的花药培养表明，‘女峰’花药的再生能力明显高于其他3个品种；‘丰香’花药再生能力最差，没有获得再生植株[14]。

生理状态方面，查中萍等研究认为，‘丰香’草莓第1级花序具有较好的培养效果，其愈伤组织诱导率显著高于第2、第3级花序，且培养效果稳定，诱导率高；而第2、第3级花序的花药不仅诱导频率较低，不同年份的培养效果也不一致[15]。赵志惠等在‘宝交早生’草莓上的研究显示，第1、第2级花序愈伤组织诱导率较高，一般在60%左右；第3级花序诱导率较低，均在25%左右[16]。

发育时期的研究表明，单核期花粉是诱导愈伤组织和分化不定芽的最适宜时期，此时花蕾直径为4mm左右，花瓣尚未开裂，花药直径约为1mm且呈淡黄色。此时接种愈伤组织诱导率显著高于单核靠边期或接近双核期[17，18]。

2.2 预处理措施

低温处理是提高花药培养再生率的预处理措施之一，4～8℃处理3d被认为是最适宜的低温处理措施，其再生率高于不处理、＜3 d的低温处理和5 d的低温处理[15，19，20]。也有研究结果显示，最佳低温处理时间以 1d为好[21]。

消毒措施方面，牛建新等研究认为，75%酒精浸泡4s+0.1%升汞处理6～10min是灭菌的最佳组合[22]。而乔奇等研究认为，最佳处理措施是用70%酒精浸泡1s，然后用0.1%升汞消毒4min，最后用无菌水冲洗三四次[23]。

2.3 基本培养基及外源激素配比

草莓花药培养的基本培养基一般为MS。徐振南等研究认为，B5适合作为愈伤组织诱导的基础培养基，其诱导率明显高于 MS、N6、E1[24]。而张敏在‘法兰地’草莓的花药培养中发现，MS培养基要优于B5、N6、W14培养基[25]。王玉民的研究认为，再生植株培养基以1/2A为好[26]。造成上述不同结果的原因可能是草莓基因型存在差异。

草莓花药培养基通常分为愈伤组织诱导培养基和分化培养基。晁慧娟等以‘甜查理‘为试材研究显示，诱导最适培养基是MS+BA1.0mg/L+2，4-D2.0mg/L；不定芽分化最适培养基为MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L[19]。查中萍以‘丰香’草莓为试材研究显示，最适诱导培养基为MS+BA0.5mg/L+KT0.1mg/L+NAA2.0mg/L；分化培养基为MS+BA0.5mg/L+ZT2.0mg/L+NAA0.2mg/L[27]。不同草莓基因型具有不同的最适激素配比，因此培养基激素最佳配比仍需进一步的试验摸索和总结。

一些新型的细胞分裂素也被用于草莓花药培养试验。吴伟民等将CPPU用于草莓愈伤组织诱导和分化，结果表明，诱导培养基添加CPPU 1 mg/L有利于草莓花药愈伤组织的形成，但植株的分化率较低，仍需分化培养基诱导[28]。王敬东等将TDZ用于草莓花药培养，结果显示，MS+TDZ1.0mg/L+NAA0.5mg/L适用于草莓愈伤组织的分化，分化率高达75%；但TDZ对草莓愈伤组织的诱导无显著作用[29]。

2.4 糖、培养基添加物及培养基固化剂

草莓花药培养采用的碳源通常为蔗糖，浓度以3.0%为好[27]。其他碳源也有所应用。徐振南的研究显示，乳糖作为碳源的愈伤组织诱导率显著高于蔗糖、甘油、葡萄糖，培养基最适乳糖浓度为3.0%～5.0%[24]。张敏等研究了果糖、麦芽糖、蔗糖和葡萄糖对‘法兰地’草莓的愈伤组织诱导效果，结果显示，3.0%麦芽糖是最优碳源[25]。不同碳源及浓度与蔗糖效果的比较还有待于进一步研究。

无机或有机添加物对草莓花药培养也有不同程度的促进作用。吴伟民在品种‘硕香’和品系88-16-5愈伤组织分化培养中发现，添加5～15mg/LAgNO3均可提高不定芽的分化率，以8mg/LAgNO3较为适宜[30]。王玉民研究发现，三十烷醇2.0mg/L对诱导草莓花药愈伤组织再生植株有一定的促进作用[26]。

草莓固化剂一般采用琼脂，也有学者对新型固化剂结冷胶（Gelrite）进行了应用研究。吴伟民的研究结果显示，随着结冷胶浓度的提高，愈伤组织诱导率呈下降趋势，以1～2g/L结冷胶处理愈伤组织诱导率较高，形成的愈伤组织松软，生长速度快；在3～8 g/L结冷胶培养基上，愈伤组织呈致密颗粒状，改变了愈伤组织的形态，但并未提高其分化率。因此，有必要进一步研究不同形态愈伤组织的分化条件[31]。

2.5 培养条件

温度对草莓花药愈伤组织的诱导率和分化率都有不同程度的影响。查中萍等的研究结果表明，20℃下培养形成的愈伤组织比25℃下形成的愈伤组织状态好，有利于芽分化[15]。顾玉成等的研究结果表明，22℃和25℃培养时，愈伤组织诱导率分别为61.30%和68.36%，前者的愈伤组织优于后者[20]。

暗培养对于草莓花药愈伤组织的诱导也有一定作用。牛建新等用遮光方法暗培养1周后发现，同一种培养基暗培养的愈伤组织诱导率均较光培养高[21]。这与用茎叶切块诱导愈伤组织具有相同的规律，可能与草莓愈伤组织的形成需要弱光有关。

3 草莓花药培养脱毒存在的问题与展望

脱毒率高、操作简单是草莓花药培养再生的优点。然而将其应用于生产仍然有一些需要解决的问题。首先是遗传稳定性。花药再生植株的遗传变异是客观存在的[27]，因此将其用于生产必需严格评价，确保其与取材品种基因型的一致。除田间鉴定外，可以利用开发的分子标记技术结合细胞学观察技术予以鉴定。其次是花药培养再生率较低，目前不同的品种再生率有很大的差异，不少品种难以获得花药再生植株。因此，迫切需要一套标准化的技术规程或数据库系统来解决这个问题，这有待于今后基础理论的发展和培养技术的优化。相信解决了上述问题，草莓花药培养脱毒技术将能够更好地服务于我国草莓产业。

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