猪流行性腹泻病毒的分子生物学特性以及胰酶对其作用机理

张永香　陈海南　陈樨　张如梅（.福州大北农生物技术有限公司35004；.湖北省襄阳市襄州区畜牧兽医局4404）



猪流行性腹泻病毒的分子生物学特性以及胰酶对其作用机理

张永香1陈海南2陈樨1张如梅1
（1.福州大北农生物技术有限公司350014；2.湖北省襄阳市襄州区畜牧兽医局441104）

猪流行性腹泻病毒（PEDV）在体外分离培养需依赖胰酶，目前胰酶对猪流行性腹泻病毒的作用机理尚未完全清晰，文中从分子生物学方面阐述胰酶对猪流行性腹泻病毒的作用。

猪流行性腹泻病毒分子生物学胰酶

猪流行性腹泻（PED）是由猪流行性腹泻病毒引起的猪的高度接触性肠道传染性疾病。临床上以引起仔猪水样腹泻、呕吐、脱水等为主要特征。该病一年四季均可发生，但以每年的冬、春季节为发病高峰期。传播途径主要通过消化道传播，即粪-口传播，无需传播媒介。猪群一旦感染病毒可持续存在，各个年龄段的猪均易感，但以哺乳仔猪的发病率和病死率最为严重，且耐过的仔猪也易成“僵猪”［1-2］。由于当前缺乏有效的治疗和防控措施，使其成为业界持续关注的焦点。

1　PEDV的病原学特性

PEDV属于冠状病毒科、冠状病毒属的成员，与其他冠状病毒成员一样，该病毒粒子的形态特征呈多形性，外有囊膜，囊膜上有花瓣状纤突。病毒在4℃、pH 5.0～9.0以及37℃、pH 6.5～7.5时稳定［1］。猪的胃内pH 4左右，肠道pH值较稳定，从十二指肠pH 7.5到结肠pH 6.5呈逐渐衰减。小肠是病毒感染宿主的主要靶器官，而病毒是如何抵抗胃酸和蛋白酶的水解作用而保持侵染活性进入小肠的，至今尚未见明确报道，推测病毒在37℃条件下可能具更强的耐酸碱能力。目前PEDV只有一个血清型，无凝集红细胞的特性，但经胰酶处理后可凝集兔的红细胞，使病毒具血凝性［3］。

2　PEDV分子生物学特性

2.1基因组结构PEDV为不分节段的单股正链RNA病毒，其核酸具感染性，大小为28～30 kb。基因组5'端有一个帽子结构（cap），3'端有一个Poly（A）尾，其从5'→3'依次为5'-UTR-ORF1-S-ORF3-sM-M-N-3'-UTR。与其他冠状病毒相比，该病毒的ORF1基因与S基因之间无其他基因，推测缺乏的可能就是冠状病毒编码相关血细胞凝集酶的基因［4］，所以，PEDV不具血凝性。

2.2基因编码非结构蛋白及其功能ORF1基因编码的是一种非结构的复制酶蛋白（Rep），该蛋白在病毒早期侵入宿主细胞发挥着极为重要的作用。而ORF3基因编码的是一个功能未知的多态性非结构蛋白，通过ORF3基因序列比对，发现野毒株、弱毒株之间存在基因缺失现象，而缺失的基因可作为病毒强弱毒株的鉴定，同时ORF3蛋白的表达还被认为与病毒毒力有关［5-6］。

2.3基因编码的结构蛋白及其功能S基因编码的S蛋白（纤突蛋白）是一种病毒粒子表面的糖蛋白，该蛋白可识别靶细胞，促进病毒和细胞膜的融合达到介导病毒进入靶细胞的作用。同时在疫苗的免疫反应中也起着重要的作用，还可介导机体中和抗体的产生［6-7］。sM基因（E基因）编码E蛋白（小膜蛋白），M基因编码M蛋白，都在病毒的自我组装和出芽过程中起重要的作用；其中M蛋白还能介导机体产生ɑ-干扰素，而且在补体存在时还可诱导中和抗体的产生［8］。M蛋白和E蛋白可以形成具有干扰源活性的类似病毒粒子样的伪颗粒［9］。N基因编码N蛋白，主要形成核衣壳，在病毒基因组的转录复制中起作用。

3　胰酶的作用机理

3.1胰酶作用于病毒的机理冠状病毒是囊膜病毒，进入宿主细胞主要有两种途径，即细胞膜与病毒囊膜的融合和细胞的胞吞。而冠状病毒一般是通过S蛋白的融合而进入宿主细胞的［10］。PEDV的早期分离需依赖胰酶，目前胰酶对PEDV的作用机理尚未完全清晰，但它在病毒进入细胞和释放出细胞的过程中都发挥着重要的作用。当病毒在体外培养时，一旦与受体结合后，其S蛋白需借助外源蛋白酶（胰酶）改变其构象（将S蛋白切割成S1区域和S2区域），促进病毒与细胞发生融合。其中切割成的S1区位于蛋白的表面，主要与宿主细胞上的受体结合；而S2区位于病毒内部，能介导病毒与宿主细胞的融合［7］；而在胰酶缺失时，PEDV与受体结合后可利用酸性环境激活S蛋白使其融合［10］。当病毒与细胞发生融合后才会介导核衣壳穿入宿主细胞进行复制，同时S蛋白继续留在细胞膜表面，以介导细胞与相邻细胞之间的融合，形成多核体，正是这种多核体细胞的形成才有利于病毒的复制。当病毒完成复制后还需借助胰酶作用才能释放出来，进而感染邻近的细胞［11］。所以，胰酶的作用主要是作用于病毒本身，帮助病毒的穿入与释放。也有学者提出胰酶对PEDV的切割作用，仅针对粘附在宿主细胞表面的病毒起作用，并非是病毒感染细胞所必需的。

3.2胰酶作用于细胞的机理胰酶在细胞分散消化过程中主要是使细胞间的蛋白质水解，达到细胞相互离散的效果。冠状病毒感染宿主细胞主要通过细胞间的融合，形成易于观察的合胞体，但PEDV感染宿主细胞却需借助外源蛋白（胰酶）的作用才可观察到合胞体［10-11］。由于Vero细胞可抵抗较高浓度胰酶的作用，因此，该细胞常用于PEDV的分离培养。并且随着胰酶浓度增加，病毒感染Vero细胞的效果就越明显［10］。同时胰酶还能增强病毒对Vero细胞的感染力。经胰酶处理后的病毒可使细胞间发生融合，形成合胞体和细胞空泡化［3］，因此，胰酶不仅作用于病毒本身还可作用于靶细胞；有文献还指出胰酶能破坏干扰素，使病毒更易侵染宿主细胞［12］。因此，胰酶可促进病毒感染细胞和增加病毒的滴度。

4　小结

胰酶是PEDV早期体外分离培养所必需的，胰酶在病毒感染细胞、细胞间的融合以及病毒的释放过程中都起着重要的作用。因此，胰酶不仅可以作用于病毒还可作用于细胞。病毒经继代后可在不依赖外源蛋白（胰酶）的培养液中也能感染宿主细胞，但被胰酶“驯化”的病毒（商品化弱毒疫苗）经基因测序发现，其S基因上存在碱基或氨基酸突变现象，而M基因和N基因却无明显突变［13］，这可能是导致目前商品化疫苗免疫效果不佳的原因。

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M olecular biological characteristics of porcine epidem ic diarrhea virus and itsmechanism of trypsin

Zhang Yongxiang1Chen Hainan2Chen Xi1Zhang Rumei1
（1.Fuzhou Dabeinong Biotech Co.Ltd.，Fuzhou 350014；2.Xiangzhou District Animal Husbandry and Veterinary Bureau，Xiangyang City，Hubei 441104）

Porcine epidemic diarrhea virus（PEDV）isolated in vitro rely on trypsin，the currentmechanism of action of trypsin on porcine epidemic diarrhea virus has not yet fully clear，this paper from the molecular biology of trypsin porcine epidemic diarrhea virus effect.

Porcine epidemic diarrhea virus Molecular biology Trypsin

A

1003-4331（2016）03-0031-02

福建省科技重大专项（2013Y31010019）资助。

张永香（1985-），女。华南农业大学硕士研究生，临床兽医学专业，zyxvet@163.com。