结合黏附分子家族A表达水平与鼻咽癌细胞株放疗敏感性的关系研究*

田允鸿，曾 星，邱慧芝，史建军，谢国丰，黄东兰，王红梅，郑荣辉，张伟军

(广州医科大学附属肿瘤医院放疗科一区，广州 510515)



结合黏附分子家族A表达水平与鼻咽癌细胞株放疗敏感性的关系研究*

田允鸿，曾 星，邱慧芝，史建军，谢国丰，黄东兰，王红梅，郑荣辉，张伟军△

(广州医科大学附属肿瘤医院放疗科一区，广州 510515)

目的 研究结合黏附分子家族A(JAMA)表达水平与鼻咽癌细胞株放疗敏感性的关系。方法 过表达或干扰CNE2和HONE1细胞株中JAMA的表达，然后采用不同剂量X射线进行照射，24 h后检测细胞克隆形成能力及细胞凋亡变化，了解JAMA在鼻咽癌放疗中的作用。通过Western blot检测JAMA不同表达水平细胞株放疗后的相关信号通路蛋白。结果 JAMA低表达细胞株对放疗更敏感：JAMA低表达后，D0值在CNE2细胞株中从3.26±0.78下降为1.92±0.23；Dq值从46.51±4.27下降至32.12±3.19。放疗诱导的凋亡在JAMA低表达细胞株中显著增加，JAMA低表达后，细胞凋亡率从6.9%±0.9%上升至13.7%±1.3%；HONE1细胞凋亡率从6.5%±1.1%上升至12.3%±1.7%；JAMA过表达细胞株中显著减少。结论 JAMA表达水平与鼻咽癌细胞株放疗敏感性密切相关，JAMA能增加鼻咽癌细胞株放疗抵抗。

结合黏附分子家族A；鼻咽肿瘤；放疗敏感性

鼻咽癌是发生于鼻咽黏膜的恶性肿瘤，其恶性程度较高，转移能力强，早期易发生淋巴结和远处转移，并具有相当高的病死率。据世界卫生组织统计，80%的鼻咽癌发生于中国，尤其高发于广东地区[1]。近年来分子生物学的发展和放疗技术的进步使鼻咽癌治疗效果得到了较大的提高，但鼻咽癌的治疗抵抗以及复发仍是影响患者生存的重大障碍[2]。因此，了解鼻咽癌治疗抵抗及复发机制，寻找可靠的治疗靶标有极其重要的意义。结合黏附分子家族A(Junctional adhesion molecule A，JAMA)是位于细胞间的跨膜紧密连接蛋白，它在细胞的侵袭、血小板聚集和淋巴细胞黏附等方面起重要作用[3]。大量研究显示，JAMA与乳腺癌患者的不良预后密切相关，并能促进细胞增殖及细胞株上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transitions,EMT)[4]。因此，本试验欲研究JAMA表达水平与鼻咽癌细胞株放疗敏感性的关系。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 CNE2和HONE1细胞株由南方医科大学肿瘤研究所保存。CNE2和HONE1用含10%胎牛血清的RMPI 1640培养，37℃，5%CO2培养箱贴壁培养处于对数生长期状态良好的细胞，用0.05%胰酶消化传代，取指数生长期细胞进行试验。

1.2 过表达质粒构建 具体构建步骤见文献[4]，简单步骤如下：(1)从CNE2细胞株基因组中克隆得到完整的目的基因(JAMA CDS区)；(2)按TIANGEN试剂盒DP103说明完成pWPI质粒提取，并用PacI和PmeI双酶切JAMA及质粒；(3)酶切后片段及质粒采用T4连接酶体系进行连接；(4)质粒转化及扩增并进行测序验证。

1.3 过表达质粒或siRNA瞬时转染试验(24孔板) (1)转染前1 d，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板在不含抗生素，含血清的培养基中。使其能在转染日达到80%～90%；(2)对于每孔细胞，使用50 μL无血清Opti-MEM®培养基稀释shRNA(shRNA 300～600 ng,shRNA CGU ACG CGG AAU ACU UCG A)[4]，轻轻混匀；(3)使用前将Lipo2000转染试剂轻轻混匀，每孔细胞用50 μL无血清Opti-MEM®培养基稀释1 μL LipoTM2000转染试剂，室温孵育5 min；(4)混合稀释的质粒和稀释的LipoTM2000，此时体积是100 μL，轻轻混匀，室温放置20 min以使shRNA- LipoTM2000复合物形成；(5)将24孔板中的旧营养液吸出，用无血清培养基清洗2次。加入0.5 mL无血清Opti-MEM®培养基；(6)逐滴加入100 μL 质粒-LipoTM2000复合物到每孔中，边加边前后来回摇动培养板，轻轻混匀；(7)在37 ℃，5%CO2中孵育24～48 h更换培养基。

1.4 平板克隆形成试验 收集贴壁培养细胞制成单细胞悬液，重悬于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，然后计数，等比稀释成不同浓度的细胞。细胞按预定数量接种于6孔板：设0、2、4、6 Gy和8 Gy 5个剂量组，各剂量组设3个复孔。细胞接种后置于培养箱孵育3 h后按不同剂量组照射。静置培养14 d后，终止培养并以PBS缓冲液洗涤细胞2次，每孔加入1.5 mL甲醇固定细胞10 min；PBS清洗2次，每孔加入1 mL 1%的结晶紫染色后，在显微镜下计算细胞大于50个克隆数。按公式计算：克隆形成率=生成的克隆数/接种细胞数×100%；存活分数(survival fraction，SF)=受照射细胞的克隆形成率/对照组细胞克隆形成率×100%。对所得的SF平均数进行分析,运用GraphPad Prism 5.0软件进行单击多靶模型曲线拟合，并根据单击多靶模型求出D0、Dq及N值。

1.5 凋亡检测 Caspase-3活性检测：胰酶消化贴壁细胞，离心收集细胞，小心吸除上清液，同时确保没有细胞被吸除，PBS洗涤1次后收集细胞加入裂解液(2×106/100 μL)，冰浴裂解15 min。参照碧云天Caspase-3检测试剂盒说明进行进一步的检测。流式细胞仪检测凋亡：加入适量胰酶细胞消化液消化收集细胞。用PBS轻轻重悬细胞并计数。取5×104重悬的细胞，1 000 r/min离心5 min，弃上清液，加入195 μL Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。然后再加入5 μL Annexin V-FITC，轻轻混匀。 室温避光孵育10 min。1 000 r/min离心5 min，弃上清液，加入190 μL Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。加入10 μL碘化丙啶染色液轻轻混匀，冰浴避光放置。随即进行流式细胞仪检测。

1.6 细胞照射 采用Varian 2100C直线加速器6 MV X线为放射源，固定源皮距照射，剂量率300 MU/min，SSD=100 cm，PDD=80%，照射野10 cm×10 cm。

1.7 Western blot检测Akt信号通路 细胞转染JAMA-shRNA和Scramble后培养24 h，采用RIPA裂解液提取细胞总蛋白(南京凯基)，Bradford法测定蛋白质浓度。制备好SDS-PAGE胶，每孔上样30 μg蛋白，进行SDS-PAGE电泳。压缩胶电压设定为60 V，30 min；分离胶电压设定为120 V，1 h。电泳完毕，根据Marker指示切下目的蛋白所在位置凝胶(60×103)，然后转移至PVDF膜上。用5%脱脂奶粉/TBST封闭PVDF膜1 h。封闭完毕，用TBST洗涤3次，每次5 min。p-Akt抗体和Akt一抗分别与靶蛋白结合。二抗与一抗结合：用1%脱脂奶粉/TBST稀释二抗(1∶1 000)，与PVDF膜孵育1 h，室温轻摇。TBST洗涤3次，每次5 min。再用TBS洗涤5 min。显影(ECL法)：ECL A液250 μL+B液250 μL，高灵敏度化学发光成像系统下成像拍照。用Image J对Western blot检测结果进行灰度分析。

2 结 果

2.1 平板克隆试验结果 试验结果显示(图1)，JAMA表达降低后，CNE2细胞株D0值从3.26±0.78下降为1.92±0.23；Dq值从对照组的46.51±4.27下降至JAMA低表达组的32.12±3.19；与CNE2结果相一致的是，HONE1细胞株中JAMA表达降低后，反映细胞对放射损伤敏感度的参数D0从6.30±1.01下降至2.17±0.19；反映细胞亚损伤修复能力大小的Dq值同样显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。

A:CNE2细胞株；B:HONE1细胞株。

图1 克隆形成试验结果

A、B：Caspase-3活性检测，细胞转染JAMA-shRNA 和JAMA-pWPI质粒24 h后行X射线照射，24 h后检测CNE2(A)和HONE1(B)细胞株中Caspase-3活性；C、D：流式细胞仪检测细胞株转染JAMA-shRNA和JAMA-pWPI质粒后，CNE2(C)和HONE1(D)细胞株放疗后凋亡情况；*：P<0.05，**：P<0.01。

图2 凋亡检测结果

2.2 凋亡检测结果 如图2A和2B结果显示，在JAMA低表达细胞株中Caspase-3活性显著升高，反之，在JAMA高表达细胞株中活性显著减低：CNE2细胞株接受2 Gy射线照射后，Caspase-3活性在JAMA低表达组上升了约29%，JAMA高表达组下降了约31%；HONE1接受2 Gy射线照射后，Caspase-3活性在JAMA低表达组上升了约17%,JAMA过表达后Caspase-3活性显著降低约20%。结果提示射线照射后，JAMA-shRNA组鼻咽癌细胞株凋亡更明显。进一步采用流式细胞仪分析放疗后，JAMA不同表达水平细胞株凋亡情况。如图2C和2D结果所示，JAMA低表达组中，细胞凋亡显著增加：CNE2细胞株接受2 Gy照射后，细胞凋亡从对照组的8.9%±1.0%上升至JAMA低表达组的12.7%±1.3%；HONE1接受2 Gy照射后，细胞凋亡从对照组的7.8%±0.9%上升至11.6%±0.6%，过表达JAMA后，HONE1细胞接受2 Gy放疗后细胞凋亡下降至5.9%±0.8%。总之，JAMA低表达组细胞接受射线照射后凋亡显著增加，反之，JAMA过表达细胞株接受射线照射后细胞凋亡显著减少。

2.3 Western blot检测Akt信号通路 Western blot检测结果显示，在JAMA低表达细胞株中，总Akt变化并不明显，p-Akt蛋白表达量却显著减低(图3A和B)。 然而ERK信号通路在JAMA不同表达水平细胞株中，放疗后并没有显著差异(图3C)。

A：Western blot检测CNE2细胞株转染JAMA-shRNA并行射线照射后相关信号通路结果；B、C：使用Image J对Western blot检测结果进行灰度分析。**：P<0.01，与Scramble组比较。

图3 Western blot检测相关信号通路

3 讨 论

鼻咽癌是我国广东地区高发的恶性肿瘤，其远处转移率及病死率均较高。放疗是鼻咽癌最重要的治疗手段之一，尽管放疗手段有了较大的进步，但是放疗抵抗仍然是治疗失败的重要原因之一[1,5]。因此，研究鼻咽癌细胞放疗抵抗机制显得尤为重要。既往研究显示，JAMA能影响乳腺癌及小肠内皮细胞功能，但是JAMA在鼻咽癌放疗敏感性方面的研究鲜有报道。笔者研究了JAMA表达水平与鼻咽癌细胞株放疗敏感性的关系，发现JAMA与鼻咽癌细胞株放疗敏感性密切相关，JAMA能增加鼻咽癌放疗抵抗，这种作用是通过Akt信号通路起作用的。

JAMA与多种肿瘤预后及治疗效果密切相关。Mcsherry等[6]采用组织芯片技术发现JAMA高表达的乳腺癌患者预后相对较差，作者以高表达JAMA的乳腺癌细胞株MCF-7为研究对象，结果显示JAMA能增加β1整合素表达而增加乳腺癌细胞的侵袭能力[7-8]。进一步研究结果显示，JAMA与HER2共表达，降低JAMA表达能减少HER2和ER受体表达[9]。另外有研究证实JAMA能影响正常小肠内皮细胞增殖，影响与细胞黏附功能密切相关的E-cadherin等表达[10-11]。更重要的是有研究显示JAMA能诱导鼻咽癌CNE2和HONE1细胞株EMT的发生。来自172例鼻咽癌患者的组织标本显示，高表达JAMA与远处转移和不良预后密切相关[4]。总之，JAMA高表达与患者不良预后密切相关。本研究结果证实，JAMA能增加鼻咽癌细胞株放疗抵抗，这可能是JAMA高表达患者预后不良的另一重要原因。

Akt信号通路与许多肿瘤基因及多种信号受体相关，是肿瘤中经常被激活的通路，并在肿瘤发生机制研究及肿瘤治疗中扮演了重要角色[12]。大量研究显示Akt通路的激活在肿瘤细胞侵袭中起了重要作用[13]。既往研究显示，JAMA蛋白能通过激活细胞中小分子G蛋白Ras超家族成员-1(Ras-proximate-1，Rap1)调节细胞对外界刺激的反应并影响与细胞黏附功能密切相关的E-cadherin蛋白表达[11]。Kortholt等[13]研究了Rap1与PI3K信号通路的关系，结果证实Rap1能直接结合至PI3K的Ras结合区域，增加PIP3表达水平[14]。NAVA等[10]证实JAMA能通过抑制Akt/β-catenin信号通路活性影响正常小肠内皮细胞增殖。总之，这些研究结果间接证实了JAMA可能通过Akt信号通路起作用。笔者通过试验发现，JAMA能通过Akt信号通路增强鼻咽癌细胞的放疗抵抗。

综上所述，本试验证实了JAMA能增加鼻咽癌细胞株放疗抵抗，初步的机制研究结果显示，这种机制与Akt信号密切相关。尽管需要通过回复Akt以及过表达JAMA等方法，进一步研究其放疗增敏机制，但是这样的结果已经给了研究人员一个很重要的提示。这为鼻咽癌放疗抵抗机制的研究提供了一点基础，为鼻咽放疗增敏提供了新的可行的方向。

[1]Lee AW,Ma BB,Ng WT,et al.Management of nasopharyngeal carcinoma:current practice and future perspective[J].J Clin Oncol,2015,33(29):3356-3364.

[2]Suarez C,Rodrigo JP,Rinaldo A,et al.Current treatment options for recurrent nasopharyngeal cancer[J].Archiv Oto-Rhino-Laryngol,2010,267(12):1811-1824.

[3]Kelly KR,Espitia CM,Zhao W,et al.Junctional adhesion molecule-A is overexpressed in advanced multiple myeloma and determines response to oncolytic reovirus[J].Oncotarget,2015,6(38):41275-41289.

[4]Tian Y,Tian Y,Zhang W,et al.Junctional adhesion molecule-A,an epithelial-mesenchymal transition inducer,correlates with metastasis and poor prognosis in human nasopharyngeal cancer[J].Carcinogenesis,2015,36(1):41-48.

[5]Chua ML,Wee JT,Hui EP,et al.Nasopharyngeal carcinoma[J].Lancet(London,England),2015,8(2):1-13.

[6]McsherryEA,McGeeSF,JirstromK,etal.JAM-Aexpressionpositivelycorrelateswithpoorprognosisinbreastcancerpatients[J].IntJCancer,2009,125(6):1343-1351.

[7]McSherry EA,Brennan K,Hudson L,et al.Breast cancer cell migration is regulated through junctional adhesion molecule-A-mediated activation of Rap1 GTPase[J].BCR,2011,13(2):R31.

[8]Severson EA,Lee WY,Capaldo CT,et al.Junctional adhesion molecule A interacts with Afadin and PDZ-GEF2 to activate Rap1A,regulate beta1 integrin levels,and enhance cell migration[J].Mol Biol Cell,2009,20(7):1916-1925.

[9]Brennan K,McSherry EA,Hudson L,et al.Junctional adhesion molecule-A is co-expressed with HER2 in breast tumors and acts as a novel regulator of HER2 protein degradation and signaling[J].Oncogene,2013,32(22):2799-2804.

[10]Nava P,Capaldo CT,Koch S,et al.JAM-A regulates epithelial proliferation through Akt/beta-catenin signalling[J].EMBO Rep,2011,12(4):314-320.

[11]Kooistra MR,Dube N,Bos JL.Rap1:a key regulator in cell-cell junction formation[J].J Cell Sci,2007,120(Pt 1):17-22.

[12]肖高春，童仕伦，郑勇斌，等.PI3K/AKT及MEK/ERK信号通路在肿瘤血管内皮细胞迁移中的作用[J].重庆医学，2015,44(11):1452-1456.

[13]Fang J,Zhou SH,Fan J,et al.Roles of glucose transporter-1 and the phosphatidylinositol 3kinase/protein kinase B pathway in cancer radioresistance(review)[J].Mole Med Rep,2015,11(3):1573-1581.

[14]Kortholt A,Bolourani P,Rehmann H,et al.A Rap/phosphatidylinositol 3-kinase pathway controls pseudopod formation [J].Mol Biol Cell,2010,21(6):936-945.

Study on relation between junctional adhesion molecule family A expression level and radiosensitivity of nasopharyngeal carcinoma cell line*

TianYunhong,ZengXing,QiuHuizhi,ShiJianjun,XieGuofeng,HuangDonglan,WangHongmei,ZhengRonghui,ZhangWeijun△

(FirstWards,DepartmentofRadiotherapy,AffiliatedTumorHospital,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510515,China)

Objective The radiotherapy resistance is one of important causes for nasopharyngeal carcinoma(NPC)treatment failure.Junctional adhesion molecule A(JAMA)is closely correlated with the tumor poor prognosis.Thus this experiment is to investigate the relationship between JAMA expression and the radiosensitivity of NPC.Methods To overexpress or interfere the JAMA expression in CNE2 and HONE1 cell lines.Then different doses of X-ray were adopted to conduct irradiation.The cell clone formation capacity and cellular apoptosis change were detected after 24 h.The role of JAMA in the NPC radiotherapy was understand.The related signal pathway protein in cell lines with different JAMA expression was detected by Western blot.Results The cell lines with low JAMA expression were more sensitive to radiotherapy:After low JAMA expression,the D0 value in the CNE2 cell line was decreased from 3.26±0.78 to 1.92±0.23;the Dq value was decreased from 46.51±4.27 to 32.12±3.19.The radiotherapy induced apoptosis was significantly increased in the cell lines with low JAMA expression,after low JAMA expressing,thcellular apoptosis was elevated from 6.9%±0.9% to 13.7%±1.3%;the HONE1 cellular apoptosis was elevated from 6.5%±1.1% to 12.3%±1.7%;JAMA overexpression cell lines were significantly decreased.The preliminary mechanism research results showed that JAMA played the effect via Akt signal pathway. Conclusion This research results verifiy that JAMA expression level is closely correlated with the radiosensitivity of NPC cell line:JAMA can increase the radiotherapy resistance of NPC cell lines,which provides a new feasible research direction for NPC enhancing radiosensitivity.

junctional adhesion molecule A；nasopharyngeal neoplasms；radiosensitivity

��·基础研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.33.003

国家自然科学基金资助项目(81502342)；广州医科大学博士启动基金(2014C45)。 作者简介：田允鸿(1984-)，博士，主治医师，主要从事肿瘤侵袭和转移机制、EMT、microRNA方面的研究。△

R739.6

A

1671-8348(2016)33-4616-03

2016-03-28

2016-05-12)