甜玉米芯多糖提取及抗凝血活性初探

马永强,王 鑫,高 爽,周恪驰

(哈尔滨商业大学 食品工程学院省高校食品科学与工程重点实验室,黑龙江哈尔滨 150076)



甜玉米芯多糖提取及抗凝血活性初探

马永强,王 鑫*,高 爽,周恪驰

(哈尔滨商业大学 食品工程学院省高校食品科学与工程重点实验室,黑龙江哈尔滨 150076)

对甜玉米芯多糖进行提取并纯化,并对其抗凝血活性进行初步研究。采用水提法提取甜玉米芯多糖,三氯乙酸、酶及Sevag-酶法脱除蛋白,双氧水和树脂法进行脱色研究,多糖醇沉分级后进行体内外抗凝血研究。结果表明:水提法提取甜玉米芯多糖得率为16.7%,Sevag-酶法脱蛋白效果最好,蛋白脱除率为84.94%,多糖保留率为70.74%。D301R阴离子大孔树脂脱色效果最佳,脱色率为46.17%,多糖保留率为99.23%。甜玉米芯醇沉分级后多糖对出血时间(BT)和凝血时间(CT)均有显著影响(p<0.05),各组分均可以延长活化部分凝血活酶时间(APTT)和凝血酶时间(TT)(p<0.05),但对凝血酶原时间(PT)影响不显著(p>0.05),其中SCP-80抗凝血效果较好。

甜玉米芯,多糖,提取,抗凝血

随着人们的经济水平不断提高以及膳食的变化,高脂和其导致的血栓日渐损害人体健康[1]。抗凝血药物在血栓的治疗过程中起到举足轻重的作用,但是有一定副作用,如容易使血小板减少[2],急需研发新型安全有效的抗凝血药物在天然产物中提取具有抗凝血作用的有效成分,进而研发新药或开发功能性食品,具备周期短、节约成本、低毒的优点[3],是当前抗凝药物研究的热点。

甜玉米,又称蔬菜玉米,是欧美等发达国家的主要蔬菜之一。因其营养价值高,且具有甜、鲜、脆、嫩的特色而深受各阶层消费者青睐[4]。甜玉米芯是甜玉米果穗去籽脱粒后的穗轴,一般占甜玉米穗重量的20%～30%,具有组织均匀、硬度适宜、韧性好、吸水性强、耐磨性能好等优点,是一种可回收利用的资源。目前,很大一部分甜玉米芯主要用在造纸制浆、生物制糖和家畜饲料等方面,部分用作糠醛、木糖醇等产品的原料,资源浪费现象严重[5-7]。多糖是甜玉米芯中所含有的具有重要生物活性的成分之一。甜玉米芯多糖是一种多组分的水溶性糖,其中含有少量的酸性糖。多糖可用于抗氧化,抗肿瘤,防治糖尿病,高血脂等疾病,可作为药物进行开发利用。赵锐等[8]研究了玉米芯多糖及其硫酸酯的抗凝血活性及其机制,实验表明玉米芯粗多糖具有抗凝血活性,并通过内源性凝血途径和共同凝血途径来实现抗凝血作用。但目前,国内外对甜玉米芯的抗凝血活性还未有研究报道。因此,本文选取甜玉米芯作为原料,提取甜玉米芯多糖,并对其纯化方法和分步醇沉进行研究,同时研究甜玉米芯多糖及其不同级分的抗凝血活性,为甜玉米芯的开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甜玉米芯 昊伟集团有限公司;雄性ICR小鼠 长春亿斯动物中心;APTT、TT、PT试剂盒 上海太阳生物科技有限公司;正己烷、氯仿、正丁醇、双氧水、无水乙醇、溴化钾、生理盐水,均为分析纯。

FW177型中草药粉粹机 天津市泰斯特仪器有限公司;81-2型恒温磁力搅拌器 上海县曹行无线电元件厂;TDL-5-A型飞鸽牌低速大容量离心机 上海安亭科学仪器厂;SHB-ⅢA型循环水式多用真空泵 巩义市予华仪器有限责任公司;TU-1900型双光束紫外可见分光光度计 上海奥析科学仪器有限公司;CA7000全自动凝血仪 北京普利生仪器有限公司;BILON-1000CT超声波提取仪 上海比朗仪器制造有限公司;Spectrum one傅里叶红外光谱仪 美国Perkin-Elmer公司。

1.2 实验方法

1.2.1 甜玉米芯多糖的提取

1.2.1.1 甜玉米芯多糖提取工艺 工艺流程：原料→干燥(60 ℃、24 h)→粉碎→脱脂→过筛(80 目)→提取→过滤→上清液→浓缩→除蛋白→脱色→静置→离心→上清液→冷冻干燥→多糖粗品

甜玉米芯经烘箱50 ℃干燥,用粉碎机粉碎,过80目筛,用正己烷脱脂。甜玉米芯在温度100 ℃、料液比1∶20(g∶mL)、时间3 h的条件下进行热水浸提,离心,取上清液,得到甜玉米芯粗多糖溶液,每组进行3次平行实验,于4 ℃贮存备用,命名为SCP。

1.2.1.2 多糖标准曲线得绘制 准确称取标准葡萄糖样品(预先在105 ℃恒温干燥箱干燥至恒重)2.00 g,溶解定容至250 mL的容量瓶中,吸取1 mL置于100 mL容量瓶中定容,即得浓度为80 μg/mL葡萄糖溶液,分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL葡萄糖溶液,各用蒸馏水稀释至体积为2.00 mL制成葡萄糖溶液稀释液,采用苯酚-硫酸法先后依次加入1.00 mL质量分数为6%的苯酚溶液和5.00 mL浓硫酸,摇匀,室温放置20 min,待冷却后于490 nm测吸光值。横坐标为多糖浓度,纵坐标为吸光值,绘制标准曲线。

1.2.1.3 多糖含量的测定 准确吸取0.1 mL甜玉米芯多糖提取液,定容至50 mL。取1.0 mL定容液,采用苯酚-硫酸法测定样品的吸光值,根据葡萄糖标准曲线方程计算甜玉米芯多糖得率。计算公式如下:

式(1)

式中:X-多糖得率,%;c-测量浓度,μg/mL;n-稀释倍数;V-提取液体积,mL;m-原料干重,g。

1.2.2 甜玉米芯多糖纯化

1.2.2.1 甜玉米芯多糖脱蛋白方法的选择 三氯乙酸法脱蛋白：吸取5份等量甜玉米芯粗多糖提取溶液20 mL,分别加入质量分数为10%、20%、30%、40%、50%三氯乙酸试剂20 mL,充分混匀后,在30 ℃条件下静置过夜后,离心(3000 r/min 10 min),收集上清液[9]。采用苯酚硫酸法测定多糖保留率,福林酚法测定蛋白质脱除率。

Sevag法脱蛋白：多糖溶液与Sevag试剂体积比为4∶1混合,常温下搅拌1 h,使其充分混匀,于分液漏斗中静置1 h,除去有机试剂层和蛋白层。取适量上层甜玉米芯粗多糖溶液进行粗多糖和蛋白质含量测定[10]。继续向剩余的上层溶液中添加Sevag试剂,方法同上,重复上述步骤3次。测定方法同1.2.2.1。

木瓜蛋白酶法脱蛋白：吸取50 mL的甜玉米芯粗多糖提取溶液,添加酶量为2%,调节pH至7,酶解后(50 ℃,2 h),沸水浴5 min,冷却后离心(3000 r/min,10 min),除去变性酶沉淀[11]。测定方法同1.2.2.1。

Sevag-酶法脱蛋白：采用木瓜蛋白酶法处理后进一步用Sevag法脱蛋白[12],测定方法同1.2.2.1。

脱蛋白指标的计算

式(2)

式中:C1为脱蛋白处理前甜玉米芯多糖液中粗多糖含量;C2为脱蛋白处理后甜玉米芯多糖液中粗多糖含量;

式(3)

式中:A1为脱蛋白处理前甜玉米芯多糖液中蛋白含量;A2为脱蛋白处理后甜玉米芯多糖液中蛋白含量。

1.2.2.2 甜玉米芯多糖脱色方法的选择 采用H2O2和静态吸附法(活性炭、D301阴离子交换树脂、D152阳离子交换树脂、AB-8大孔吸附树脂、201×7阴离子交换树脂)对甜玉米芯多糖溶液脱色,选择脱色率较高及多糖损失率较低的方法。

H2O2法：将30%浓度的H2O2加入甜玉米芯多糖溶液中至溶液体积的40%,在40 ℃恒温水浴锅中保温2 h,分别在400、490 nm处测定其吸光度[13],计算脱色率及多糖损失率。

静态吸附法：采取静态吸附法对多糖溶液脱色,取预处理后的活性炭、D301阴离子交换树脂、D152阳离子交换树脂、AB-8大孔吸附树脂、201×7阴离子交换树脂按2∶15(g∶mL)分别加入已除蛋白的甜玉米芯多糖溶液[14-15],振荡2 h(25 ℃,120 r/min)后取滤液,分别在400、490 nm处测定其吸光度,计算脱色率及多糖损失率。

计算公式

式(4)

式中:A1-400 nm处脱色前的吸光值;A2-400 nm处脱色后的吸光值

式(5)

式中:C1为脱色前甜玉米芯多糖液中粗多糖含量;C2为脱色后甜玉米芯多糖液中粗多糖含量。

1.2.2.3 紫外吸收光谱分析 准确称取甜玉米芯粗多糖组分2mg,加入蒸馏水充分溶解,配制多糖溶液,以蒸馏水作为空白对照,在190～400nm波长范围内进行紫外光谱扫描。

1.2.3 甜玉米芯多糖分级 取9份浓缩液各15mL,分别以乙醇浓度10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%和90%进行醇沉静置过夜。取200mL浓缩液,以乙醇浓度10%进行醇沉静置过夜,离心,得到醇沉物称量质量。将醇沉物复溶,定容至20mL,采用苯酚-硫酸法测定多糖含量,计算得率命名为SCP-10。将离心所得上清液添加乙醇至浓度为20%继续醇沉,收集醇沉物,命名为SCP-20。依照上述步骤操作,再依次调整乙醇浓度30%、40%、50%、60%、70%、80%和90%进行醇沉。

1.2.4 红外光谱检测甜玉米芯多糖及其不同级分 分别称取干燥的甜玉米芯不同级分多糖1.0mg于玛瑙研钵,与溴化钾(KBr)粉末混合研磨均匀,在压片机上压片,压力在 8MPa左右,保持5min,样品放入样品室的光路中,操作OPUS软件,使红外光谱仪在 4000～450cm-1波长范围内进行光谱扫描。

1.2.5 甜玉米芯多糖及不同级分抗凝血活性研究 选取ICR小鼠30只,取分步醇沉后10%～30%、40%～60%和70%～90%三个阶段得率最高的三个组分(SCP-30、SCP-50、SCP-80)进行抗凝血实验研究,按照100mg/kg剂量SCP、SCP-30、SCP-50、SCP-80腹腔注射,生理盐水为对照组,随机分成5组。

1.2.5.1 体内抗凝血活性研究 小鼠全凝血时间(CT)测定：使用眼科镊迅速将小鼠一侧的眼球摘除,在载玻片的两端分别滴1滴血滴,直径5mm左右。马上用秒表计时,每隔10s用干净针头自血滴边缘向内轻微挑动1次,观察是否挑起血丝。从开始采血到挑起血丝的所用时间为CT。而另外1滴血用来判断正常凝血情况。记录各组小鼠的CT[16]。

小鼠出血时间(BT)的测定：腹腔注射大约20min后,用手术刀在小鼠尾尖3mm处迅速切断,到血流出时开始用秒表计时,每隔30s用滤纸在尾尖吸1次血滴,直到没有血溢出(即滤纸上无血点时截止),记录BT[17]。

1.2.5.2 体外抗凝血活性研究 超声波提取的甜玉米芯多糖及不同级分按100mg/kg剂量进行实验,以生理盐水为对照组,分别取1mL不同组溶液加入清洁试管后,于40 ℃真空干燥,加入相应血浆0.5mL,测定活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)和凝血酶原时间(PT)。

2 结果与讨论

2.1 甜玉米芯多糖提取结果分析

在490nm下测得葡萄糖标准曲线,如图1,吸光度与葡萄糖质量浓度之间的回归方程为:y=0.0146x+0.0021,R2=0.9997,在浓度范围0～48μg/mL内回归方程线性显著。根据标准曲线,采用苯酚硫酸法测得甜玉米芯多糖平均得率为16.67%。

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 The standard curve of glucose

2.2 甜玉米芯多糖脱蛋白方法结果分析

由图2可知,三氯乙酸法蛋白脱除率为73.12%,多糖保留率为50.94%;Sevag法蛋白脱除率最高为96.31%,几乎完全脱除,多糖保留率较低为59.73%;木瓜蛋白酶法蛋白脱除率最低为44.32%,多糖保留率较高为70.65%;Sevag-酶法蛋白脱除率较高为84.94%,多糖保留率最高为70.72%。三氯乙酸法是酸性物质,能使蛋白质带正电荷从而与酸根负离子结合成不溶性的盐类,并伴随蛋白质分子变性,三氯乙酸同样会对多糖产生破坏,产生不期的结果[18];Sevag法是经典的脱蛋白质方法,条件比较温和,但需反复多次才能除去尽量多的蛋白质,通常耗时较长,对于少量与多糖结合很牢或被多糖包裹的蛋白,用Sevage法很难除去,这样会使得多糖粗制品中蛋白含量较高;酶法在脱除甜玉米芯粗多糖中蛋白质的同时,具有操作条件温和、利于保持多糖的活性、避免了使用有机试剂带来的危害等优点,所以酶法脱蛋白是一种脱蛋白效率较高、操作简单、多糖损失较小的有效脱蛋白的方法[19]。利用木瓜蛋白酶降解联合Sevag法脱除蛋白质,由于木瓜蛋白酶的降解作用,使得甜玉米芯粗多糖提取液中的大部分游离蛋白质和部分结合蛋白水解,减少了后续有机溶剂除蛋白的次数,从而降低了多糖随凝胶物沉淀而损失的可能,多糖的保留率提高,同时粗多糖中蛋白含量降低。综合考虑,选择Sevag-酶法对甜玉米芯多糖脱蛋白。

图2 多糖脱蛋白方法选择结果Fig.2 Results of the methods of deproteinization of polysaccharides

2.3 甜玉米芯多糖脱色方法结果分析

由图3可知,H2O2法脱色率为60.21%,多糖保留率为77.69%;活性炭脱色率为16.67%,多糖保留率为92.66%;D301R阴离子交换树脂脱色效果最好,脱色率达到46.17%,且多糖保留率最高为99.23%;D152阳离子交换树脂脱色效果最差,脱色率为4.92%,多糖保留率为95.79%;AB-8大孔吸附树脂脱色率为40.16%,多糖保留率为94.70%;201×7阴离子交换树脂脱色率较低为9.56%,多糖保留率最低为69.58%。H2O2是强氧化剂,很容易造成多糖结构的破坏,从而影响其活性[20-23];活性炭法脱色时间较长,多糖保留率低;大孔树脂具有表面积大,物理化学稳定性高、选择性好、处理能力强、解吸条件温和、吸附速度快、使用周期长、对色素的吸附能力强、可再生、成本低等性质,其操作方法简便。因此选择D301R阴离子交换树脂对甜玉米芯多糖脱色。

图3 多糖脱色方法选择结果Fig.3 Results of the methods of decolorization of polysaccharides

2.4 甜玉米芯多糖紫外光谱分析

如图4所示,紫外光谱结果显示260、280 nm处均无明显吸收峰,表明SCP中不含核酸、蛋白质等杂质成分。

图4 SCP的紫外吸收光谱图Fig.4 Ultraviolet absorption spectrumof SCP

2.5 甜玉米芯多糖分级结果分析

采用热水浸提甜玉米芯多糖,脱蛋白脱色,浓缩后进行分步醇沉,结果见图5。

图5 不同浓度乙醇分级结果Fig.5 Results of different concentration of ethanol

由图5可知,随着乙醇浓度的升高,醇沉出的多糖含量呈现平稳后递减而后上升又骤减的趋势。乙醇能够减少多糖与水的作用,使多糖脱水而相互聚集沉淀。一定浓度的乙醇对应一定分子量的多糖,待分离多糖的相对分子质量越小,沉淀多糖的乙醇浓度越高,不同浓度的乙醇可以使多糖的不用组分先后沉淀,起到分步沉淀的效果。从10%～30%趋于平稳,故选择30%乙醇浓度作为一个醇沉点。40%到50%浓度大幅度上升,选择50%乙醇浓度作为醇沉点。80%醇沉点则为60%～90%的最高点,故选择分步醇沉后10%～30%、40%～60%和70%～90%三个阶段得率最高的三个组分(SCP-30、SCP-50、SCP-80)进行后续实验研究。

2.6 红外光谱分析

从图6中可以看出,三种级分多糖的红外吸收光谱图相似,在3400～3500 cm-1处,均出现一强而宽的吸收峰,是多糖上的O-H形成分子间、内氢键;吸收谱带在2349.21 cm-1均出现一窄而尖的吸收峰,为饱和C-H伸缩振动的信号;在1636 cm-1处出现一吸收峰是质子化羧酸中羰基 C=O 的伸缩振动造成的;吸收谱带在1385 cm-1处,是C-H引起的变角振动。三种多糖的吸收谱带在890 cm-1附近出现的小峰是次甲基的横向振动引起的,说明三种糖存在β-糖苷键。

图6 三种级分甜玉米芯多糖红外光谱图Fig.6 Infrared spectrum of three fractionations of SCP

2.7 体内抗凝血活性研究

出血时间和凝血时间是检测具有抗凝活性的前提条件,通常选为初筛指标。

表2 体外抗凝血活性检测结果表Table 2 Results of anticoagulant activity in ±s,t(s))

由表1可知,与肝素组比较，甜玉米芯多糖及不同级份多糖对小鼠CT和BT均有延长。甜玉米芯粗多糖对CT和BT影响不显著(与对照组比较)。SCP-30对CT影响显著,其它级份甜玉米芯多糖对CT和BT影响极显著,表明甜玉米芯多糖对小鼠的凝血起到抑制作用。

Table 1 Results of anticoagulant

组别剂量(mg/kg)CTBT对照组10053.8±1.0294.35±0.84肝素组1009.19±0.15A8.45±0.32ASCP10053.61±0.77B95.74±0.53BSCP-3010056.96±1.06aB112.04±1.02ABSCP-5010072.28±0.81AB120.54±2.09ABSCP-8010095.75±1.05AB131.46±2.69AB

注:a,p<0.05,A,p<0.01 与对照组比较;b,p<0.05,B,p<0.01 与肝素组比较，表2同。

2.8 体外抗凝血活性研究结果分析

APTT、TT和PT是分别反映内源性、外源性和共同凝血途径的指标。由表2可知,甜玉米芯多糖及各级分多糖对APTT和TT影响均显著,但对PT无显著影响(与对照组比较)。这说明甜玉米芯多糖及各级分多糖是通过内源性凝血途径和共同凝血途径完成的抗凝血作用。

3 结论

采用甜玉米芯为原料,通过水提法提取甜玉米芯多糖,得率为16.67%。多糖提取据报道还有微波辅助法、酶法、超声波辅助法等,但容易使大分子多糖降解成小分子物质,改变原有物质的性质及分子量,采用传统的水提法提取多糖,不需要特殊设备,生产工艺成本低,安全。适合工业化大生产,是一种可取的提取方法。但是由于水的极性较大,容易把蛋白质、苷类等水溶性的成分浸提出来,因此必须对粗提取进行纯化。研究表明,Sevag-酶法脱蛋白最好,蛋白脱除率为84.94%,多糖保留率为70.74%。D301R阴离子大孔树脂脱色效果最佳,脱色率为46.17%,多糖保留率为99.23%。采用分步醇沉选取三个阶段得率较高的组分(分别为SCP-30,SCP-50和SCP-80)进行体内外抗凝血实验。表明分步醇沉后对CT和BT均有显著影响(p<0.05),原塘对其影响不显著(p>0.05)。说明甜玉米芯经纯化醇沉后具有一定的抗凝血作用。APTT、PT和TT分别反映内源性、外源性和共同凝血途径的指标[8]。实验表明各组分均可以延长APTT和TT时间(p>0.05),但对PT影响不显著(p<0.05),其中SCP-80抗凝血效果较好。初步推测甜玉米芯多糖是通过内源性和共同凝血途径达到抗凝血作用。通过红外分析表明,三种级份多糖均存在β-糖苷键。甜玉米芯部分用作糠醛、木糖醇,少量用于清储饲料,很大一部分作为农业废弃物被燃烧,造成很大的浪费及污染。研究其甜玉米芯中多糖的提取并对其生物活性进行探讨。为从中开发出针对性强的高效低毒、安全实用的药物、保健品、血浆代用品等,是开发利用甜玉米芯资源的最终目标,无疑具有重大的社会经济效益和广阔的市场应用前景。

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Extraction and anticoagulant activities of polysaccharides from sweet corncob

MA Yong-qiang,WANG Xin*,GAO Shuang,ZHOU Ke-chi

(Key Laboratory of Food Science and Engineering,School of Food Engineering,Harbin University of Commerce,Harbin 150076,China)

Themethodsofextraction,purificationandanticoagulantactivitiesofpolysaccharideswereresearchedfromsweetcorncob.Thepolysaccharideswereextractedwiththemethodofwater,theremovingproteinofpolysaccharideswiththemethodsoftrichloroaceticacid,enzymeandSevag-enzymerespectively.Thedecolorationofpolysaccharidesbyhydrogenperoxideandresin,anticoagulantactivitiesofpolysaccharideswereresearchedaftergradingusealcohol.Theresultsshowedthattheoptimumyieldofpolysaccharideswasupto16.7%withthemethodofwater.Thedeproteinizationeffectofsevag-enzymewasbest,theremovalrateofproteinandtherecoveryrateofpolysaccharidesofsweetcorncobswas84.94%and70.74%,respectively.ThedecolorizationeffectofD301Rresinwasbest,thedecolorizationrateandtherecoveryrateofpolysaccharidesofsweetcorncobswas46.17%and99.23%,respectively.Anticoagulantactivitiesin vivoandvitroshowedthatpolysaccharidesanddifferentfractionsofsweetcorncobshadasignificantinfluenceonbleedingtimeandbloodcoagulationtime(p<0.05),allthecomponentscanprolongAPTTandTT(p<0.05),buthadnosignificanteffectonPT(p>0.05),theanticoagulantactivitiesofSCP-80wasbetter.

sweetcorncob;polysaccharides;extraction;anticoagulant

2016-04-08

马永强(1963-)，男，硕士，教授，研究方向：食品化学，E-mail：qyma126@163.com。

*通讯作者:王鑫(1984-)，女，在读博士，工程师，研究方向：食品生物技术，E-mail：wangxinfood@163.com。

哈尔滨商业大学研究生创新项目(YJSCX2015-392HSD)。

TS209

A

1002-0306(2016)21-0114-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.21.014