葡萄糖(半乳糖,乳糖)硬脂酸单酯的生物活性对比

2016-12-16朱振元宋巧英李盛峰

食品工业科技 2016年21期

关键词：硬脂酸化合物培养基

朱振元,宋巧英,李盛峰

(食品营养与安全教育部重点实验室,天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津 300457)

葡萄糖(半乳糖,乳糖)硬脂酸单酯的生物活性对比

朱振元,宋巧英,李盛峰

(食品营养与安全教育部重点实验室,天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津 300457)

硬脂酸单酯,生物活性,抗氧化,抑菌

糖酯,是由糖与脂肪酸相互作用生成的一类有机化合物,具有抑菌[1-3]、抗癌[4]、表面活性剂[5-6]、治疗疾病[7-8]和抗氧化[9]等作用。目前,对糖酯的研究逐渐成为热点,Ferrer M[10]等提出6-O-麦芽糖月桂酸单酯可抑制植物乳杆菌的生长,而6,6′-O-麦芽糖月桂酸二酯对微生物无明显的抑制作用。由此可知,糖酯的酯密度对其抑菌性有显著的影响。张希[11]提出蔗糖月桂酸二酯或多酯的抑菌活性弱于蔗糖单酯,因此单糖脂肪酸单酯的抑菌性明显优于二糖或多糖脂肪酸单酯。由此可推测糖酯的糖基密度对其抑菌性有显著影响。赵磊[12]等提出糖酯中酯的碳链越短其抑菌性越强,因此酯类的长度对其生物活性有影响。但尚无关于糖酯的糖基种类对其生物活性的影响,我们在前期研究工作中成功合成了一系列糖硬脂酸单酯[13](如图1),本文将在前期工作基础上通过体外抗氧化实验和抑菌实验探讨葡萄糖(半乳糖,乳糖)硬脂酸单酯的生物活性并做出对比。为开发相应的产品以及扩大其在日化、食品和医药等领域的应用提供理论依据。

图1 各化合物构型分子结构图Fig.1 Molecular structures of each compound

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

青霉素,DPPH-乙醇溶液,邻苯三酚溶液分析纯阿拉丁试剂(上海)有限公司;Tris-HCl缓冲液,无水乙醇,氯化钠,盐酸化学纯天津江天化工技术有限公司;大肠杆菌(E.scherichiacoli)、沙门氏杆菌(SalmonellaTyphimurium)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、根霉(Rhizopus)、毛霉(Mucor)、青霉(Penicillium)、和曲霉(Aspergillus) 天津科技大学生物资源与功能食品实验室。

α-D-吡喃葡萄糖-1-硬脂酸酯(化合物1)、β-D-吡喃葡萄糖-1-硬脂酸酯(化合物2)、α-D-吡喃半乳糖-1-硬脂酸酯(化合物3)、β-D-吡喃半乳糖-1-硬脂酸酯(化合物4)、O-(β-D-吡喃半乳糖)-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖-1-硬脂酸酯(化合物5)、O-(β-D-吡喃半乳糖)-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖-1-硬脂酸酯(化合物6)在前期研究工作中合成。

UV型紫外可见分光光度计上海光谱仪器有限公司;生物洁净工作台苏州安泰空气技术有限公司;恒温恒湿箱上海一恒科技有限公司;回转式恒温调速摇瓶柜上海欣蕊自动化设备有限公司;电热恒温水浴锅北京市长风仪器仪表公司;精密电子天平沈阳龙腾电子称量仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 体外抗氧化实验

式(1)

1.2.1.2 清除·OH能力的测定参考马建华[16]的方法。在试管中依次加入2mL浓度为20、40、60、80、100、200、300μg/mL的样品溶液(溶剂为蒸馏水),2mL浓度为6mmol/L的FeSO4溶液,2mL浓度为6mmol/L的H2O2溶液,静置10min,然后分别加入2mL浓度为6mmol/L的水杨酸溶液,静置30min,于510nm的波长下测定吸光度值Ai;扣底物组以蒸馏水代替底物水杨酸测吸光度值Aj;对照组以蒸馏水代替样品测吸光度值A0。同时用相同浓度的VC代替样品作为阳性对照,其余步骤一致[15]。计算公式见式(1)。

1.2.1.3 清除DPPH·能力的测定采用寇智斌等[17]的方法。取浓度为1.5×10-4mol/L的DPPH-乙醇溶液2mL,然后分别加入2mL浓度为 20、40、60、80、100、200、300μg/mL的样品溶液(溶剂为蒸馏水),摇匀,室温静置30min,在517nm下测吸光度Ai;扣底物组以无水乙醇代替DPPH·与样品反应,测吸光度Aj;对照组以蒸馏水代替样液与无水乙醇反应,测吸光度A0。同时用相同浓度的VC代替样品作为阳性对照,其余步骤一致[15]。计算公式见式(1)。

1.2.2 抑菌实验

1.2.2.1 培养基的制备细菌培养基(牛肉膏蛋白胨培养基):参考程庆等[18]的方法配制。霉菌培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基,PDA):参考颜松[19]的方法配制。

1.2.2.2 菌种的活化与菌悬液的制备将溶化的细菌培养基倒入到干净的试管中,灭菌,摆斜面。在无菌的条件下将供试菌种接入到培养基中,37 ℃,培养24h。然后制成一系列的菌悬液,浓度大约为3×108cfu/mL,备用[20-21]。

1.2.2.3 抑菌圈实验准备若干直径6mm,长2cm的圆筒状物体,120 ℃干热灭菌20min,备用。将前期配制的细菌和霉菌固体培养基分别熔化后慢慢倒入平皿中,体积约为10mL,凝固后用无菌的镊子取6个之前准备好的圆筒状物体间隔一定的距离插入到培养基中,且在培养基的正中央也插入一个。

细菌实验:取100μL细菌菌悬液到15mL未凝固的牛肉膏蛋白胨培养基中,然后倒入到插有圆柱状物体的平皿中,凝固后,将圆柱状物体拔出,在周围的6个孔中分别加入100μL[24]的各样品化合物溶液,得到400μg/mL的样品化合物溶液。将100μL90%的无菌甲醇加入到中间的一个孔中作对照,将青霉素加入到另一个孔中作对照。每种菌做3组平行。37 ℃培养24h后,以十字交叉法测量抑菌圈直径[22-23]。

霉菌实验:将15mL热溶的PDA培养基倒入到插有圆柱状物体的平皿中,凝固后,将圆柱状物体拔出,用无菌的涂布器将100μL(3×108cfu/mL)霉菌菌悬液涂布在培养基上,在周围的6个孔中分别加入100μL(400μg/mL)[24]各样品化合物溶液,将100μL90%的无菌甲醇加入到中间的孔中做对照。每种菌做3组平行。28 ℃培养48h后,以十字交叉法测量抑菌圈直径[22-23]。

1.2.2.4 生长曲线的绘制将提前准备好的干净试管分为空白对照组和加药组,加药组又分为6个样品化合物(1,2,3,4,5,6),空白与每个样品均做3组平行。在试管中分别加入4mL细菌液体培养基,0.1MPa高压灭菌20min,备用。在超净工作台中向各试管中加入0.5mL的菌悬液,加药组加0.5mL样品溶液(溶剂为甲醇,终浓度为300μg/mL);空白组加0.5mL甲醇做对照。37 ℃,150r/min培养。将对照组和加药组的试管按照编号顺序分别于0、3、6、9、12、24、36、48h分段取出,吹吸均匀,于波长600nm处测吸光度,根据OD值绘制出生长曲线[25]。

化合物浓度(μg/mL)20406080100200300化合物123.3±0.1a31.1±0.1a40.9±0.8a45.1±0.2a55.2±0.7a64.7±0.5a65.1±0.9a化合物223.1±0.5a30.2±0.2a39.7±0.8a47.8±0.5a55.1±0.4a64.2±0.4a66.1±0.3a化合物326.1±0.3a28.2±0.6a36.9±0.3a45.1±0.7a55.7±0.8a65.7±0.7a67.2±0.6a化合物426.2±0.7a28.9±0.3a36.8±0.5a46.2±0.9a56.1±0.2a65.9±0.3a66.1±0.2a化合物522.2±0.6a28.7±0.2a39.2±0.7a44.8±0.5a52.9±0.9a61.1±0.9a60.2±0.1a化合物623.2±0.4a29.1±0.3a38.9±0.8a45.9±0.2a54.2±0.1a62.1±0.3a62.3±0.8aVC56.2±0.3b64.3±0.8b69.4±0.1b73.1±0.9b79.8±0.7b82.3±0.7b88.6±0.4b

注:数据为3次实验的平均值,同列数据肩标字母相同、不同分别表示差异不显著(p>0.05),显著(p<0.05)表2,表3同。

化合物浓度(μg/mL)20406080100200300化合物118.2±0.1a22.8±0.1a30.1±0.8a42.9±0.2a55.1±0.7a63.9±0.5a64.3±0.9a化合物218.3±0.5a23.2±0.2a30.3±0.8a43.1±0.5a55.9±0.4a65.1±0.4a64.5±0.3a化合物319.2±0.3a24.7±0.6a31.1±0.3a39.9±0.7a51.2±0.8a61.8±0.7a60.2±0.6a化合物420.2±0.7a25.1±0.3a30.9±0.5a40.2±0.9a51.9±0.2a61.2±0.3a61.2±0.2a化合物519.1±0.6a21.4±0.2a30.2±0.7a39.8±0.5a54.2±0.9a59.5±0.9a59.4±0.1a化合物619.2±0.4a21.2±0.3a29.7±0.8a40.5±0.2a53.4±0.1a60.1±0.3a60.2±0.8aVC48.8±0.6b54.6±0.3b65.3±0.9b72.9±0.5b81.8±0.6b89.7±0.4b93.2±0.5b

1.3 数据统计

数据分析采用EXCEL和SAS 9.3软件进行分析,实验数据以平均值±标准差表示。组间差异用Duncan检验。

2 结果与分析

2.1 体外抗氧化实验

2.1.2 清除·OH能力的测定如表2所示,化合物1～6对·OH具有一定的清除能力,在20～200 μg/mL浓度范围内,清除率与浓度成正相关,随着浓度的增大而增大。当浓度大于200 μg/mL时,各质量浓度的化合物对·OH的清除率变化不明显。实验结果同时表明,同一质量浓度的各化合物清除·OH的能力差异不显著。虽然不同浓度下各化合物对·OH的清除率低于阳性对照VC,但已表现出较强的清除能力。

2.1.3 清除DPPH·能力的测定如表3所示,化合物1～6对DPPH·具有一定的清除能力,在20～200 μg/mL浓度范围内,清除率与浓度成正相关,即随着浓度的增大而增大,当浓度大于200 μg/mL时,各质量浓度的化合物对DPPH·的清除率变化不明显。实验结果同时表明,同一质量浓度的各化合物清除DPPH·的能力差异不显著。虽然不同浓度下各化合物对DPPH·的清除率低于阳性对照VC,但已表现出较强的清除能力。

表3 各化合物清除DPPH·能力对比Table 3 The ability of cleaning DPPH· of each ±SD,n=3)

表4 不同化合物对细菌的抑制效果Table 4 Effects of different compounds on the bacteria

注:数据为3次实验的平均值(包括中间孔的直径6 mm);同列数据肩标字母相同、不同分别表示差异不显著(p>0.05),显著(p<0.05);抑菌圈直径大于6 mm者判为有抑菌作用,抑菌圈直径小于或等于6 mm者判为无抑菌作用,表5同。

表5 不同化合物对霉菌的抑制效果Table 5 Effects of different compounds on the mold

2.2 抑菌实验

2.2.1 抑菌圈测定实验如表4所示,由抑菌圈直径的大小可以看出化合物1～6对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和沙门氏菌这四种菌都具有一定的抑制作用,但抑菌效果比青霉素弱,相对于甲醇空白组抑菌效果明显。且六种化合物的抑菌能力基本相当,无显著性差异。

如表5所示,由抑菌圈直径的大小可以看出,化合物1～6对霉菌(根霉、毛霉、青霉和曲霉)的抑菌效果不明显,各化合物之间没有显著性差异,且比甲醇抑菌效果弱,说明这六种化合物对霉菌的抑制作用较弱。

2.2.2 生长曲线测定实验通过在不同时间段测定菌悬液在波长为600 nm处的吸光值(OD值)来绘制受试菌的生长曲线,然后根据生长曲线的变化来判断抑菌效果,吸光值越小,活菌的数量值越小,抑菌效果越好。

如图2～图5所示,根据吸光值的大小可以看出化合物1～6对细菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和沙门氏杆菌)均有一定的抑制作用。在培养期间加药组的活菌数始终少于对照组活菌数,表明化合物在停滞期、对数期、稳定期均抑制了受试菌的生长,且各化合物的抑菌能力比甲醇的抑菌能力强。且整个时间段内各加药组的活菌数基本相当,表明这六种化合物的抑菌能力基本相当。

图2 各化合物对大肠杆菌生长曲线的影响Fig.2 The growth curve of E.coli affected by each compound

图3 各化合物对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响Fig.3 The growth curve of Staphylococcus aureus affected by each compound

图4 各化合物对枯草芽孢杆菌生长曲线的影响Fig.4 The growth curve of Bacillus subtilis affected by each compound

图5 各化合物对沙门氏杆菌生长曲线的影响Fig.5 The growth curve of Salmonella affected by each compound

3 结论

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Comparison of the biological activity of glucose,galactose and lactose stearate

ZHU Zhen-yuan,SONG Qiao-ying,LI Sheng-feng

(Key Laboratory of Food Nutrition and Safety,Ministry of Education,College of Food Science and Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China)