高效液相色谱概况及其在水质监测中的应用
2016-12-15叶南刘飞
叶 南 刘 飞
(长江委水文局长江下游水环境监测中心，江苏 南京 210011)
高效液相色谱概况及其在水质监测中的应用
叶 南 刘 飞
(长江委水文局长江下游水环境监测中心，江苏 南京 210011)
介绍了高效液相色谱的方法，原理及其在水质监测中的应用，通过甲萘威重复性测试、平行性测试以及质控样测试，经过精密度偏性验证后得出高效液相色谱仪的精密度和准确度符合规范要求，可应用于水质监测分析。
水质监测；高效液相色谱仪；测试监测分析
1 液相色谱基本原理及其特点
1.1 液相色谱理论的发展
色谱法最早是由俄国植物学家茨维特(Tswett)在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。
液相色谱法开始阶段是在室温和常压下通过大直径的玻璃管柱用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，该方法柱效低、时间长(常有几个小时)、高效。
液相色谱法(LC)是在经典液相色谱法的基础上，于20世纪60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(HPLC)。同时，因分析速度快而被称为高速液相色谱法(HSLP)，还称现代液相色谱。
1.2 高效液相色谱基本原理
HPLC又称高效液相色谱法，是一种区别于经典液相色谱,基于仪器方法的高效能分离手段。20世纪70年代开始，广泛应用于化工、食品、饮料，生物技术、医药、环境等领域。
HPLC的分离原理就是利用待分离的各种物质在两相中的分配系数、吸附能力等亲和能力的不同来进行分离。HPLC主要由进样系统、输液系统、分离系统、检测系统和数据处理系统等组成。HPLC技术的发展趋向于高速化、高效化、自动化、智能化等。HPLC分离度可用下式表示：
(1)
式中，tr2,tr1为保留时间；W2,W1为组分峰底宽。当R=0.75时，两峰不能分离；当R=1.0时，达到一般定量分析要求，每峰纯度达到96%；当R=1.5时，两峰完全分离。
通过色谱学的基本理论——塔板理论可知，这些塔板实际是不存在的，只是一种假设，用来帮助描述色谱柱里所发生的一切。在这些塔板里面，固定相和流动相之间存在着一种平衡分析物。这种平衡里存在一种平衡系数K，定义K=C固定相/C流动相。K值越大，分析物流出时间就越长，即分析物在色谱柱中的保留时间就越长。
理论塔板数(N)用来衡量色谱柱质量好坏。理论塔板数越高，柱效越高；理论塔板高度(H)越大，柱效越低。高柱效色谱柱比低柱效色谱柱在同一保留时间峰更窄，理论塔板数越高，柱效越高。
有效塔板数可用下式表示：
(2)
有效板高可用下式表示：
(3)
不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。
1.3 高效液相色谱的结构
高效液相色谱仪器的基本结构包括泵(含脱气机)、自动进样器、色谱柱(放于柱温箱中)、检测器、系统控制软件(电脑)，如图1所示。
图1 高效液相色谱仪器的基本结构
1.4 技术指标及主要特点
高效液相色谱技术指标主要有：①检测器参数(紫外检测波长，灵敏度)；②固定相(色谱柱及内径、长短)；③流动相(种类及配比，等度或梯度)；④流动相输送系统参数(流速)；⑤温度控制；⑥进样量等。
高效液相色谱主要特点为，可对世界上80%左右的有机化合物进行分离和分析，特别适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物以及生物活性物质的分离和分析，且可做制备，不同的分析对象选择不同的色谱柱，广泛应用于医药、食品、农业、生命科学、化工和环保等领域。
2 检测方法
HPLC检测器可以分为溶质性质检测器(选择型)和整体性质检测器(通用型)。选择型是对溶质的物理或化学性质响应，一般不反映流动相的变化。通用型是不管是否有溶质，对流动相任何物理性质的变化均能作出响应。
HPLC检测器选择依据主要包括：①灵敏度(信号与噪音的比值，即峰高与基线噪音的比值(S/N)检测线(LOD)∶S/N=3 定量限(LOQ)∶S/N=10，好的信噪比有利于更好的色谱峰确认，更好定量，更好地完成色谱峰纯度/均一性)；②分离的化合物/样品的化学特性(化学结构、分子量及紫外光谱等)；③流动相的影响(溶剂、缓冲盐改性剂等)；④梯度还是等度；⑤灵敏度需求；⑥采样频率；⑦是否有双检测的需求。HPLC检测器的原理及优缺点见表1。
表1 HPLC检测器的原理及优缺点
3 在水质监测中的应用
3.1 比测方案确定
选定浓度为100 μg/mL 甲萘威标准溶液配制标准曲线(分别取50，100，150，200，250，500 μl稀释到1 000 μl；配制 0.0，5.0,10.0,15.0,20.0,25.0，50 μg/mL)；选取规格Thermo C184.6 mm×250 mm色谱柱；选择甲醇：水=(3+2)为流动相；设定流动相流量为1.0 mL/min；检测波长为280 nm；柱温为35 ℃；选取重蒸馏水为空白试样；以江西省九江市湖口水文站断面的水作为天然水样，并对天然水样做双加标处理，具体做法是分别加入100 μl和200 μL甲醇中甲萘威标准溶液,并用天然水稀释到1 000 μl。
3.2 标准样品检验
选用水利部水环境监测评价研究中心GBW(E)082072的甲醇中甲萘威(西维因)，批号为20140129，其标准值为101 μg/mL，不确定度为±5%，依据《高压液相色谱法-紫外检测器》(GB/T5750.9—2006)标准分析方法，对该标准样品稀释了10倍进行了测试，12次测试结果的误差均在不确定度±5%的范围内。可见仪器的准确度很高，满足相关要求，结果详见表2。
表2 标准样品检验测试结果
注：标准值为101，不确定度为5%。
3.3 重复性测试
使用上述标准样品重复测试12次，测试甲萘威，绝对偏差范围在-2.27 μg/mL～2.19 μg/mL之间；相对偏差围在-2.25%～2.17%之间，平均偏差为-0.05，相对平均偏差为-0.04%；标准偏差为1.18，相对标准偏差为1.16%。由此可见，仪器的重复性很好，满足相关要求，详见表3。
3.4 平行性测试
仍然选取甲萘威，将湖口水样品，等分成10份，对每份样逐一测试，绝对偏差、相对偏差、相对平均偏差、标准偏差和相对标准偏差均为零，可见仪器的平行性很好，满足相关要求。
4 质量控制
4.1 质量控制基础实验
4.1.1 标准曲线绘制及线性检验
标准系列应在线性范围内选取至少6个浓度点进行测定，扣除空白值后，以响应值的数据为纵坐标，浓度值为横坐标，绘制校准曲线，见图2，并计算下列参数。
表3 重复性测试成果及其标准偏差
图2 甲萘威的标准曲线
(1) 相关系数γ为 0.999 7，满足γ≥0.999的规范要求。
(2) 列出回归方程y=a+bx，对截距a进行t检验，要求截距与零无显著性差异，否则找原因重做。检测结果t=0.003<2.776，说明截距与零无显著性差异。
4.1.2 准确度(回收试验)
进行加标回收试验，计算回收率P%，经计算回收率的平均值为104.4%，满足规范要求。标准曲线试验数据，湖口断面天然水样双加标样品试验数据以及质控样品试验数据见表4。
4.1.3 精密度偏性分析质量控制试验
用标准水样、天然水样及加标天然水样，以随机次序每天一批，每次2份，高压液相色谱法-紫外检测器共6批[5]。计算批内变异MS批内、批间变异MS批间和批内、批间变异分析等参数，并将结果填入表5。
表4 加标回收试验数据表
表5 精密度偏性检验
总标准差小于被测浓度的5%可以接受，当5%浓度低于方法给定的检测限时，即用检测限作为衡量标准。
通过加标回收试验可得出以下结论，即加标回收率检验和分析批内批间变异，检验总标准差等2种检验均合格，满足规范要求。
5 结 语
通过对高效液相色谱仪的学习、研究、比测和考核，可得出以下主要认识和结论：
(1) 高效液相色谱是一项非常成熟的现代化分析方法；
(2) 通过实验证明，仪器满足水质监测分析所要求精密度和准确度；
(3) 方法检出限适合长江水质分析的需求；
(4) 弥补和提高了实验室对于有机化合物分析的不足。
综上所述，该仪器及方法均满足相关规范技术要求，可以投入生产应用。
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[5] 中国环境监测总站，环境水质监测质量保证手册(第二版)[M].北京：化学工业出版社，2003.
(编辑：唐湘茜)
2016-09-15
叶南，男，长江委水文局长江下游水环境监测中心，工程师.
1006-0081(2016)11-0051-04
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