猪流行性腹泻疫苗毒株M基因的克隆与序列分析*

董 波，戴爱玲，李晓华，杨小燕**

(1. 龙岩学院；2.福建省生猪疫病防控工程技术研究中心)



猪流行性腹泻疫苗毒株M基因的克隆与序列分析*

董 波1,2，戴爱玲1,2，李晓华1,2，杨小燕1,2**

(1. 龙岩学院；2.福建省生猪疫病防控工程技术研究中心)

从龙岩地区某猪场使用的弱毒疫苗中，提取毒株核酸.根据GenBank已发表的CV777毒株M基因序列设计合成特异性引物，利用RT-PCR技术扩增了疫苗毒株的M基因序列，并对其进行遗传进化分析.通过分析表明，疫苗毒株与韩国毒株virulent DR13的亲缘性较近，与2010年后中国流行毒株亲缘性较远.这一结果暗示该猪场使用的疫苗对于猪群的保护能力不足，无法有效对抗现在的流行毒株，需引起重视.

猪流行性腹泻；弱毒疫苗；M基因；遗传进化分析；同源性分析

0 引言

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的，一种高传染性高接触性的肠道传染病，以食欲下降、急性腹泻伴有呕吐为主要临床特征[1].尤其对哺乳仔猪的危害较大，死亡率可达100%.目前，预防PED的主要手段是免疫接种，使用的疫苗类型有强毒疫苗，弱毒疫苗以及灭活疫苗等[2].由于强毒疫苗能够长期存在于而导致该病的反复发作，所以几乎禁止使用.而弱毒疫苗的应用性最佳，使用后的母猪抗体水平提高，仔猪的成活率得到保证，没有出现临床症状[3].因此，弱毒疫苗受到养猪场的青睐.

2010年以来，我国大面积爆发PED，造成了极大的经济损失，即使在接种了PED弱毒疫苗或灭活疫苗的猪群中，发病率依然很高[4].这提示人们现在使用的疫苗对于流行变异毒株的保护力不强，只能提供有限的免疫保护.该研究对龙岩地区某猪场使用的弱毒疫苗M基因进行克隆、测序及遗传分析，理清疫苗毒株与参考毒株以及流行毒株之间的进化关系，从基因水平分析目前龙岩地区猪场使用疫苗的可靠性，并为PED的防控提供理论基础.

1 材料与方法

1.1 样品

PEDV疫苗毒株来自龙岩地区某规模化养猪场使用的弱毒活疫苗.

1.2 主要试剂

DL2000 Marker、总RNA提取液(TaKaRa RNAiso Reagent)、病毒RNA/DNA提取试剂盒(TaKaRa MiniBEST Viral DNA/RNA Extraction Kit Ver.3.0)、AMV反转录酶、rTaq DNA聚合酶、Oligo(dT)18、dNTP、DNA Marker DL 2000、RNA酶抑制剂、pMD18-T Vector购自宝生物工程(大连)有限公司； DNA 凝胶回收试剂盒(DNA Gel Extraction Kit)及质粒提取试剂盒(Plasmid Miniprep Kit)购自 AXYGEN公司产品；感受态细胞制备试剂购自宝生物工程(大连)有限公司；氯仿、异丙醇采用分析纯试剂.

1.3 M基因的扩增、纯化

参考GenBank上发表的PEDV CV777株M基因序列，使用Premier Premier 5.0生物软件设计合成一对特异性引物，PEDV-M-F：TTCTATTCCCGTTGATGAGG，PEDV-M-R：CATGAAGCACTTTCTCACTATC.自多重RT-PCR阳性样品中扩增病毒M基因.反应条件为： 95℃预变性5 min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；最后72℃延伸10 min.使用琼脂糖凝胶电泳观察结果.

1.4 重组质粒构建和鉴定

将PCR产物纯化后连接至0.5 μL pMD18-T载体转化入DH5α感受态细胞，涂板过夜，挑取单个菌落，提取质粒，经鉴定正确后，送上海生工生物工程技术服务有限公司测序.

1.5 序列分析

将疫苗毒株与NCBI上公布的PEDV毒株进行对比，用DNAstar分析不同毒株之间的同源性，并用MAGE5.2分析疫苗毒株与选择毒株之间的遗传进化关系.所引用的已知代表毒株信息见表1.

表1 序列比对及系统发育分析中引用的PEDV毒株

2 结果

2.1 PCR扩增结果

使用特异性引物，进行PCR扩增，通过电泳凝胶成像得到图1所示的结果，得到了预计的结果，目的条带大约在681bp，与预期结果相符合.

图1 M基因PCR扩增结果

2.2 同源性分析

弱毒疫苗毒株M基因的同源性分析表明，疫苗毒株与标准毒株CV777的氨基酸同源性为98.7%，与韩国毒株SM98的同源性为97.8%，与韩国Attenuated DR13毒株的氨基酸同源性为98.7%，与中国2006年的LZC毒株的同源性为96.9%，与2008年JS2008_KC109141毒株的氨基酸同源性为98.2%，与2011年的BJ-2011-1和LC的氨基酸是同源性分别为97.3%、97.8%，与2014年FJ-ZP的氨基酸同源性为96.9%，与FJ-FQ毒株的氨基酸同源性为96.5%.

2.3 M基因系统发育分析

使用MEGA 5.2对选择的M基因进行遗传进化分析显示，可以将所选取毒株分为两个大组， G1与G2组.其中，G1组包括传统毒株CV777、2010年前中国分离毒株LCZ、SM98以及韩国毒株virulent DR13，而疫苗毒株yimiaoM也包含在G1组.系统发育分析显示(如图2所示)，疫苗毒株与韩国毒株virulent DR13的亲缘性较近，而与2010年后中国变异毒株以及2013年美国毒株亲缘性较远.

图2 PEDV M基因系统发育分析

3 结束语

在PEDV的4个结构基因中，M基因较为保守，在基因工程疫苗的设计中，可作为主要抗原[5].对PEDV M基因的检测和分析有助于了解我国目前PEDV流行毒株的流行类型.该研究中，疫苗毒株与2010年后的中国变异毒株同源性分别为95.5%～97.8%，说明疫苗毒株与变异毒株的亲缘关系较远.另外从遗传进化关系分析表明，疫苗毒株与变异毒株的亲缘关系较远,疫苗毒株与韩国virulent DR13在同一分支上，这说明他们可能来自同一祖先，也有可能疫苗毒株来源于韩国virulent DR13 毒株.遗传进化表明，G2组包括大部分2010年后中国变异毒株以及2013年美国毒株，而2012年中国毒株SD-M、KC189944在G1组里，推测与猪群可免疫带毒有关.因为弱毒疫苗存在着返祖的缺点，这可能是导致SD-M与KC189944毒株在传统毒株群中的原因.

2013年，美国爆发PED，给美国养猪业造成了严重影响，经济损失巨大[6].这次爆发的PEDV，与2010年我国爆发的PEDV的流行方式极为相似.遗传进化分析证实，两次流行的PEDV，亲缘性上很相近，可以认为来自同一祖先，属于变异毒株.而本研究选择的疫苗毒株，亲缘关系上与韩国毒株virulent DR13较近，而与变异毒株的亲缘关系较远，暗示该疫苗对于目前流行毒株的保护力不强，只能提供有限的免疫保护，需要选用更为有效的疫苗来防控目前流行的PEDV毒株.

[1] Cavanagh D. Nidovirales: a new order comprising Coronaviridae and Arteriviridae[J]. Arch Virol, 1997, 142(3): 629-633.

[2] 刘孝珍,陈建飞.时洪艳,等.2011年猪流行性腹泻病毒的遗传变异分析[J].中国预防兽医学报,2012(3):180-183.

[3] 甘海霞,梁昆,韦显凯，等.2011年广西猪群猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎调查[J].动物医学进展,2012,33(10):125-127.

[4] 郑逢梅,霍金耀,赵军,等.2010-2012年华中地区猪流行性腹泻病毒分子特征和遗传进化分析[J].病毒学报,2013,29(2):197-205.

[5] Brian D, Baric R. Coronavirus genome structure and replication[J].Curr Top Microbiol Immunol,2005(287): 1-30.

[6] Stevenson GW,Hoang H,Schwartz K J, et al.Emergance of Porcine epidemic diarrhea virus in the United States:clinical signs,lesions,and viral genomic Sequences.J Vet Digan Invest,2013(25):649-654.

(责任编辑：季春阳)

The Cloning and Sequence Analysis of M Gene of Vaccine Strains about Porcine Epidemic Diarrhea

Dong Bo1,2, Dai Ailing1,2, Li Xiaohua1,2,Yang Xiaoyan1,2

(1. Longyan College; 2. Pig Disease Prevention and Control Engineering Technology Research Center of Fujian Province)

In this study, from the region one of the weak poison vaccine used in pig farms, the virus nucleic acid is extracted. According to a published CV777 GenBank strain M gene sequence specific primers, design synthesis using rt-pcr technique amplified the vaccine strains of M gene sequences, and the analysis of genetic evolution is carried on. The analysis result shows that the vaccine strain is closed with South Korea virulent DR13, is far way with China after 2010 pandemic strain affinity. Therefore, a weak poison vaccine can't be used to protect piglets from pandemic strain infection. It need to be attach great importance.

The pig epidemic diarrhea; Weak poison vaccine; M genes; Analysis of genetic evolution; Homology analysis

2016-01-02

*龙岩学院博士启动项目(LB2014004)

Q34

A

1000-5617(2016)03-0097-04

* *通讯作者：Lyyxy1988@126.com