沧州市结核分枝杆菌间隔区寡核苷酸分型研究

曹新瑞，李雅楠，高会霞，张志，戴二黑△

沧州市结核分枝杆菌间隔区寡核苷酸分型研究

曹新瑞1，李雅楠2，高会霞2，张志2，戴二黑2△

目的初步了解沧州市结核分枝杆菌临床分离株的基因多态性和分子流行病学特征，探讨各基因型与表型耐药之间的关系。方法收集结核病患者经临床分离培养得到的结核分枝杆菌菌株及相应病例信息，提取菌株DNA，采用间隔区寡核苷酸基因分型法进行基因分型研究，采用BACTECTMMGITTM960液体培养技术进行一线抗结核药物敏感试验。运用BioNumerics 5.0软件进行聚类分析，运用Graphpad Prism 5.0软件进行数据分析。结果154例患者中男109例，女45例；初治121例，复治33例；34例有吸烟史，12例合并糖尿病。48株（31.2%）至少对链霉素、异烟肼、利福平、乙胺丁醇中的1种药物耐药。复治患者的耐药率（63.6%）显著高于初治患者耐药率（22.3%）。典型北京型菌株占所有菌株的91.6%，非典型北京型菌株占8.4%。典型北京型与非典型北京型在患者性别、治疗情况、吸烟史、糖尿病史及耐药分布上的差异均无统计学意义。结论沧州市结核分枝杆菌呈现明显的基因多态性。典型北京型菌株是该地区的优势菌株，且基因型与耐药性无关。

分枝杆菌，结核；微生物敏感性试验；流行病学,分子；聚类分析；基因分型；间隔区寡核苷酸分型

结核病是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起的呼吸道传染性疾病。分子流行病学研究能够从病原分子水平监测传染病的暴发、追踪传染源并揭示感染传播机制。本研究拟通过间隔区寡核苷酸分型技术对沧州市MTB临床分离株进行基因分型研究，以初步了解该市MTB的基因分型特征和分子流行病学特征，并采用BACTECTMMGITTM960液体培养技术进行一线抗结核药物敏感试验，探讨各基因型与表型耐药之间的关系。

1 材料与方法

1.1 菌株来源在2014年3月—10月共收集到结核分枝杆菌临床分离株154株。所有菌株来源于此期间在沧州市传染病医院就诊的结核病患者的痰标本，经临床分离培养获得，并经硝基苯甲酸-噻吩羧酸肼（PNB/TCH）鉴别培养基鉴定的结核分枝杆菌临床分离株。其中，男109例，初治81例，复治28例；女45例，初治40例，复治5例。34例有吸烟史，12例患者合并糖尿病。

1.2 主要试剂异烟肼、利福平、乙胺丁醇和链霉素含药培养基购自美国BD公司。DNA提取试剂盒购自美国Qiagen公司，2×Taq Master Mix购自北京康为世纪生物科技有限公司。PCR引物和标记探针由北京天一辉远生物公司合成。

1.3 药敏试验采用BACTECTMMGITTM960液体培养技术，按照《结核分枝杆菌药物敏感性试验标准化操作程序及质量保证手册》的液体培养标准化操作步骤进行［1］。

1.4 DNA提取将菌落从罗氏培养基上刮下，置于200 μL细菌裂解液中，置于涡流机充分震荡。金属浴100℃，10 min后拿出，置于室温2 min。13 000×g离心5 min。取上清液移至1.5 mL离心管中。-20℃保存备用。

1.5 间隔区寡核苷酸分型按照Kamerbeek等［2］建立的spoligotyping标准化程序进行实验操作。引物序列DRa:5′-GGTTITGGGTCTGACGAC-3′，5′端用生物素标记；DRb:5′-CCGAGAGGGGACG GAAAC-3′。

1.6 统计学方法运用BioNumerics 5.0软件进行聚类分析，使用Graphpad Prism 5.0软件进行卡方检验或Fisher确切概率检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 药敏试验结果154株中106株对4种一线抗结核药均敏感，48株（31.2%）至少对1种药物耐药。其中，12株单耐链霉素，9株单耐异烟肼，6株对链霉素和异烟肼同时耐药，5株对异烟肼和利福平同时耐药，13株对链霉素、异烟肼和利福平同时耐药，3株对4种药均耐药。耐多药菌株有21株，占所有菌株的13.6%，占耐药株的43.8%。复治患者的耐药率显著高于初治患者的耐药率，见表1。

Tab.1Association between drug resistance phenotypes and clinical information of patients表1 药敏试验结果与患者临床资料之间的关系

2.2 间隔区寡核苷酸分型将指纹图谱与spoligotyping国际标准数据库SpolDB 4.0进行比对，141株（91.6%）表现为1～34位点杂交呈阴性，为典型北京家族基因型。其中133株（86.4%）在35～43位点均呈杂交阳性，为典型北京家族基因型；而另外8株（5.2%）在35～43位点存在1或2位点杂交阴性，为非典型北京家族基因型。其余13株（8.4%）在1～34位点存在杂交阳性，为非典型北京家族基因型，其中包括6株T1型、4株T2型、2株H3型和1株MANU2型，见图1。典型北京和非典型北京基因型菌株在不同性别、治疗史、吸烟史、糖尿病史中的分布差异无统计学意义，见表2。

2.3 典型北京型与非北京基因型菌株的耐药分布特征典型北京与非典型北京基因型菌株在耐药性分布上的差异均无统计学意义，见表3。

Fig.1Fingerprintings of spoligotypes图1 spoligotyping基因型指纹图谱

3 讨论

本研究发现，沧州市结核分枝杆菌的总耐药率为31.2%，略低于2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查结果（36.8%）［3］。沧州市的初治耐药率为22.3%，低于北京市的初治耐药率（30.68%），但获得性耐药率为63.6%，高于北京市的获得性耐药率（56.14%）［4］。统计分析显示，复治患者的耐药率显著高于初治患者，提示抗生素治疗是造成菌株耐药的一个重要因素。因此临床上应规范使用抗结核药物，根据药敏试验结果及时调整治疗方案，同时应提高患者用药依从性，从源头上降低耐药性的产生。

Tab.2Association between spoligotypes and clinical information of patients表2 spoligotyping基因型与临床资料之间的关系

Tab.3Drug resistance characterization of the Beijing and non-Beijing family isolates表3 典型和非典型北京型菌株的耐药分布特征例（%）

近年来，由于结核分枝杆菌耐药株的广泛传播使得全球结核病疫情明显加剧，其主要原因之一就是结核分枝杆菌的变异。因此从分子水平研究结核分枝杆菌的基因特征并进行分型鉴定，明确主要流行菌型，以更准确地预测和判断结核病的暴发流行及传播方式，对结核病的有效防治具有重要意义。

沧州市优势流行菌株为典型北京型菌株，占所有菌株的91.6%，同时也发现了T1、T2、MANU2、H3等非典型北京家族基因型。在我国北方地区典型北京型检出率达76.5%［5］，内蒙古为93.26%［6］，天津市为93.63%［7］。有研究报道，典型北京型菌株的耐药率明显高于非典型北京型菌株［8］。然而，本研究显示，典型北京型与非典型北京型的耐药率无明显差异，并且在性别、治疗史、吸烟史、糖尿病史上的差异也无统计学意义。因此，本研究并不支持典型北京型菌株毒力更强、传播性更广的观点。由于本文所收集的菌株数量不够大，且时间相对集中，因此，不能全面、准确反映沧州市结核分枝杆菌的基因型分布状况以及基因型的临床意义，有待今后收集更多菌株深入研究。

［1］Wang LX.Standard operating procedures and quality assurance manual of drug susceptibility testing on mycobacterium tuberculosis［M］.Beijing：People’s Medical Publishing House，2013：1-40.［王黎霞.结核分枝杆菌药物敏感性实验标准化操作程序及质量保证手册［M］.北京：人民卫生出版社，2013：1-40］.

［2］Kamerbeek J，Schouls L，Kolk A，et al.Simultaneous detection and strain differentiation of Mycobacterium tuberculosis for diagnosis and epidemiology［J］.J Clin Microbiol，1997，35（4）：907-914.

［3］Technical Guidance Group of the Fifth National TB Epidemiological Survey,the Office of the Fifth National TB Epidemiological Survey. The fifth national tuberculosis epidemiological survey in 2010［J］. Chinese Journal of Antituberculosis，2012，34（8）：485-508.［全国第五次结核病流行病学抽样调查技术指导组、全国第五次结核病流行病学抽样调查办公室.2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查报告［J］.中国防痨杂志，2012，34（8）：485-508］.

［4］Zheng CX，Cui ZL.Prevalence survey and analysis of drug-resistant tuberculosis［J］.Laboratory Medicine and Clinic，2014，11（9）：1156-1158.［郑春秀，崔振玲.耐药结核病流行状况调查分析［J］.检验医学与临床，2014，11（9）：1156-1158］.doi:10.3969/j. issn.1672-9455.2014.09.002.

［5］Pang Y，Xia H，Jiang GL，et al.Genotyping and drug resistance analysis of Mycobacterium tuberculosis from China［J］.Chinese Journal of Laboratory Medicine，2011，34（11）：1023-1028.［逄宇，夏辉，姜广路，等.中国结核分枝杆菌寡核苷酸基因分型及其耐药性分析［J］.中华检验医学杂志，2011，34（11）：1023-1028］. doi:10.3760/cma.j.issn.1009-9158.2011.11.014.

［6］Yu Q，Su Y，Lu B，et al.Genetic diversity of Mycobacterium tuberculosis isolates from Inner Mongolia，China［J］.PLoS One 2013，8（5）：e57660.doi:10.1371/journal.pone.0057660.

［7］Xie T，Ju HF，Wang CH，et al.Ancient Mycobacterium tuberculosis Beijinggenotypeclinicalisolatesareassociatedwithdrug resistanceinTianjin，China［J］.ChineseJournalof Antituberculosis，2015，37（9）：928-932.［谢彤，巨韩芳，王春花，等.结核分枝杆菌北京基因型亚型的流行及与耐药性的关系研究［J］.中国防痨杂志，2015，37（9）：928-932］.doi:10.3969/j. issn.1000-6621.2015.09.003.

［8］Lisdawati V，Puspandari N，Rif'ati L，et al.Molecular epidemiology study of Mycobacterium tuberculosis and its susceptibility to antituberculosis drugs in Indonesia［J］.BMC Infect Dis，2015，15：366.doi:10.1186/s12879-015-1101-y.

（2016-02-23收稿2016-08-04修回）

（本文编辑魏杰）

Characterization of Mycobacterium tuberculosis isolates from Cangzhou by spoligotyping

CAO Xinrui1,LI Yanan2,GAO Huixia2,ZHANG Zhi2,DAI Erhei2△
1 Department of Laboratory Medicine,Cangzhou Infectious Disease Hospital,Cangzhou 061000,China; 2 Department of Laboratory Medicine,the Fifth Hospital of Shijiazhuang△

ObjectiveTo identify the genetic polymorphism and molecular epidemiological characteristics of Mycobacterium tuberculosis(TB)clinical isolates in Cangzhou,and explore the association between genotypes and drug resistance phenotypes.MethodsMycobacterium tuberculosis isolates were collected from TB patients treated in the Cangzhou Infectious Disease Hospital,and corresponding clinical data were also collected.The genomic DNA was extracted. Spacer oligonucleotide typing(spoligotyping)was applied to genotype the isolates.Drug susceptibility testing of first-line anti-TB drugs(streptomycin,isoniazid,rifampin,ethambutol)was performed using the BACTECTMMGITTM960 liquid medium.Cluster analysis was done by BioNumerics 5.0.Data was analyzed by Graphpad Prism 5.0 software.ResultsOf the 154 patients,109 were male and 45 were female.And 121 patients were treated for the first time,33 were retreatment,34 had smoking history,12 were complicated with diabetes mellitus.Fourty-eight strains(31.2%)were resistant to at least one of streptomycin,inoniazid,rifampicin and ethambutol.Initial drug resistance rate was 22.3%and acquired drug resistance rate was 63.6%.The drug resistance rate was significantly higher in retreatment patients than that of new cases.The Beijing family strain accounted for 91.6%of all isolates and the non-Beijing family strain accounted for 8.4%.There were no significant differences in gender,treatment history,smoking history and diabetes history between patients with the Beijing genotype and patients with non-Beijing genotype.ConclusionMycobacterium tuberculosis in Cangzhou exhibits high genetic diversity.The Beijing genotype is the predominant no association with drug resistance.

mycobacterium tuberculosis;microbial sensitivity tests;epidemiology,molecular;cluster analysis; genotyping;spoligotyping

R378.91+1

A

10.11958/20160071

沧州市科技局攻关项目（14130204）

1河北省沧州市传染病医院检验科（061000）；2河北省石家庄市第五医院检验科

曹新瑞（1969），女，副主任检验师，学士，主要从事微生物学检验研究

△通讯作者E-mail:daieh2008@126.com