精神分裂症锚蛋白重复序列3基因多态性及表达研究☆

冉柳毅　程宇琪　董成龙　姜红燕　吴桂霞　杨舒然　许秀峰

·论 著·

精神分裂症锚蛋白重复序列3基因多态性及表达研究☆

冉柳毅*程宇琪*董成龙*姜红燕*吴桂霞△杨舒然*许秀峰*

目的 探讨锚蛋白重复序列3（ankyrin repeat 3，ANK3）基因多态性和基因表达与精神分裂症的关系。方法 采用TaqMan探针等位基因分型技术对456例中国汉族精神分裂症患者（患者组）和495名正常对照者（对照组）ANK3基因多态性位点rs10994336、rs10994359进行基因分型，并对基因型、等位基因、单体型频率进行比较；然后采用TaqMan探针及实时荧光定量PCR方法检测另外30例急性期精神分裂症患者和26名正常对照外周血ANK3基因mRNA的表达水平。结果 患者组与对照组rs10994336和rs10994359基因型、等位基因频率分布的差异无统计学意义（P＞0.05）。单体型分析显示，由rs10994336-rs10994359组成单体型C-C、C-T、T-C的频率分布在患者组与对照组间差异无统计学意义（P＞0.05）。与对照组相比，急性期精神分裂症患者外周血ANK3基因的mRNA表达水平略高，但差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 本研究未发现ANK3基因位点rs10994336、rs10994359多态性与精神分裂症的关联，急性期精神分裂症患者外周血中ANK3基因的表达水平未见异常。

精神分裂症 锚蛋白重复序列3基因 多态性 基因表达

目前认为精神分裂症是由遗传因素和环境因素共同作用导致大脑发育异常[1]。遗传因素在精神分裂症的发病机制中扮演着重要角色，该病具有很高的遗传度，双生子研究显示其遗传度约80%[2]。位于10q21的锚蛋白重复序列3（ankyrin repeat 3，ANK3）基因编码的Ankyrin-G在大脑中广泛表达且参与神经发育过程[3]。2011年全基因组关联研究（genome wide association study，GWAS）发现ANK3基因多态性位点rs10994359与精神分裂症和双相情感障碍均具有关联[4]，2012年中国上海YUAN等[5]发现位点rs10994336与精神分裂症有关联，但是北欧、德国的研究未能验证这一关联[6-7]。ROUSSOS等[8]在尸检研究中发现精神分裂症患者大脑颞上回ANK3基因mRNA水平降低，WIRGENES等[9]在精神分裂症患者外周血中发现ANK3基因mRNA水平增高。为进一步明确ANK3基因与中国汉族精神分裂症的关系，本研究在中国汉族样本中分析ANK3基因的2个单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）位点rs10994336和rs10994359，并对急性期精神分裂症患者外周血ANK3基因的表达水平进行分析。

1　对象与方法

1.1研究对象

1.1.1基因多态性研究对象 患者组来自2013年3月至2014年11月昆明医科大学第一附属医院精神科、云南省精神卫生中心精神分裂症患者。入组标准：①符合《美国精神障碍诊断与统计手册第四版》（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders,Fourth Edition，DSM-Ⅳ）精神分裂症诊断标准，并由2名精神科副主任医师或以上职称医师诊断；②汉族；③年龄＜65岁。排除标准：患有其他精神疾病或严重躯体疾病。共入组456例患者，男185例，女271例，年龄14～60岁，平均（34.2±11.1）岁。

对照组来自昆明医科大学第一附属医院的健康体检者。入组标准：①当前或既往无患精神障碍；②汉族；③年龄＜65岁。排除标准：患有严重躯体疾病。共入组495名对照，男206名，女289名，年龄20～60岁，平均（35.2±10.1）岁。患者组和对照组年龄（t=-1.41，P=0.16）和性别（χ2=0.11，P= 0.74）差异无统计学意义。

1.1.2基因表达研究对象 患者组来自2015年1～4月昆明医科大学第一附属医院精神科门诊和住院治疗的急性期精神分裂症患者。入组标准：①符合DSM-Ⅳ精神分裂症诊断标准，由2名精神科副主任医师或以上职称医师诊断，PANSS评分＞60分；②汉族；③年龄＜65岁。排除标准：患有其他精神疾病或严重躯体疾病。共入组30例患者，其中5例mRNA扩增失败。25例患者纳入分析，男10例，女15例，年龄15～44岁，平均（24.6±6.5）岁，病程0.5～15年，平均（3.8±3.9）年，PANSS评分62～101分，平均（78.3±9.5）分。

对照组来自同期昆明医科大学第一附属医院的健康体检者及实习生。入组标准：①当前或既往无精神障碍史；②汉族；③年龄＜65岁。排除标准：患有严重躯体疾病。共入组26名对照，其中1名mRNA扩增失败。25名对照纳入分析，男9名，女16名，年龄21～30岁，平均（25.7±2.2）岁。25例患者与25名对照者年龄（t=-0.79，P=0.44）和性别（χ2=0.09，P=0.77）差异无统计学意义。

研究对象中精神分裂症患者及家属均对本研究知情同意并签署书面知情同意书，所有对照本人签署知情同意书。本研究得到昆明医科大学伦理委员会审核批准。

1.2基因多态性研究方法

1.2.1提取DNA 456例患者及495名对照各采集静脉血2～5 mL置于乙二胺四乙酸管抗凝，采用AxyPrep血基因组DNA小量试剂盒（AxyPrepTMBlood Genomic DNA Miniprep Kit）提取基因组DNA，置于-80℃保存备用。

1.2.2基因分型 采用TaqMan探针基因分型技术对rs10994336、rs10994359位点进行分型，引物和探针由美国ABI公司定制（探针序列号分别为：C_ 31344821_10，C_31344870_10），PCR反应试剂Taq⁃Man® Genotyping Master Mix由美国ABI公司提供。PCR反应体系为7.5 μL，包括模板2 μL，2× TaqMan®Genotyping Master Mix 5.0 μL，20×SNP Assay Mix 0.5 μL。反应条件：95℃预变性10 min，（95℃变性15 s，60℃退火1 min）×40个循环。PCR反应和荧光信号收集均在ABI7300实时荧光定量PCR仪（96孔板）上进行，以SDS 2.0图像分析软件Allelic Discrimination程序分析不同等位基因所标识的FAM和VIC终点荧光信号强度，判定待测样本的基因型。

1.3基因表达研究方法

1.3.1总RNA提取及逆转录合成cDNA 30例患者和26名对照者各抽取静脉血3 mL，2%的乙二胺四乙酸抗凝。采用Super超纯全血总RNA快速提取试剂盒（北京博凌科为生物科技有限公司）提取外周血总RNA。使用HiFi逆转录试剂盒（北京博凌科为生物科技有限公司）合成cDNA，cDNA合成的总体积40 μL，反应体系及反应条件参照试剂盒操作手册。

1.3.2ANK3基因表达水平检测 使用TaqMan MGB探针法在ABI 7500型实时荧光定量PCR系统上进行实时荧光定量PCR扩增，以检测ANK3基因的mRNA表达水平。使用管家基因GUSB作为内对照基因以标化目的基因的表达水平。ANK3基因和GUSB基因表达的检测探针（探针序列号分别为ANK3：Hs00241738_mL，GUSB：HS99999908_mL）均于美国ABI公司定制。每个样本的ANK3基因和内对照GUSB基因均重复3次，同时设立6个阴性对照孔。实时荧光定量PCR反应体系共20 μL：cDNA模板6 μL，TaqMan Universal PCR MasterMix 10 μL，TaqMan MGB Probe+Primer 1 μL，RNase-free H2O 3 μL。反应条件：50℃孵育2 min，95℃预变性10 min，（95℃变性15 s，60℃退火1 min）×40个循环。患者组PCR扩增失败5例，对照组PCR扩增失败1例。采用比较循环数（cyclethreshold，CT）的方法进行相对定量，使用SDS ver⁃sion 2.3软件进行数据处理。实时荧光定量PCR的结果以CT值显示，CT值为每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。每个样本的ΔCT值=单个样本平均CT（ANK3基因）-单个样本平均CT（GUSB基因）。以对照组的平均ΔCT值为参照标准，计算每例患者的ΔΔCt值（每例患者的ΔΔCT值=每例患者ΔCT值-对照组平均ΔCT值），以2-ΔΔCt反映基因表达差异的倍数，即目的基因的表达水平[10]。

1.4统计学方法 基因多态性分析均在SHEsis遗传分析在线软件（http：//analysis.bio-x.cn/）中进行。采用χ2检验进行Hardy-Weinberg遗传平衡度检验，以及两组间等位基因和基因型频率比较。统计效能采用Quanto 1.2.4软件计算。计算两位点间连锁不平衡（linkage disequilibrium，LD）程度，用D'值度量，D'值范围0～1，通常2个位点之间的D'值较高说明LD程度较高。对rs10994336、rs10994359位点进行单体型分析，舍弃在每组中频率＜3%的单体型，组间单体型频率比较采用χ2检验，单体型与精神分裂症的关联用OR值及其95%CI分析。ANK3基因表达量使用SPSS 17.0进行统计分析，两组间比较采用独立样本t检验。检验水准α为0.05，双侧检验。

2　结果

2.1精神分裂症ANK3基因多态性

2.1.1Hardy-Weinberg平衡检验 ANK3基因2个SNPs位点rs10994336和rs10994359的基因型分布在患者组和对照组中均符合Hardy-Weinberg平衡定律（均P＞0.05），具有群体代表性。

2.1.2样本统计效能 rs10994336最小等位基因频率（minor allele frequency，MAF）为0.218，统计效能（1-β）为0.958；rs10994359的MAF为0.306，统计效能（1-β）为0.979。

2.1.3基因型和等位基因分布 患者组与对照组间rs10994336、rs10994359位点的基因型和等位基因频率分布差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

2.1.4连锁不平衡及单体型关联分析 对2个SNPs位点（rs10994336、rs10994359）进行相邻位点间LD分析，结果显示D'=0.961，提示2个SNPs位点之间存在LD现象。对2个SNPs位点构成的单体型进行分析，由rs10994336-rs10994359组成的单体型C-C（P=0.80）、C-T（P=0.41）、T-C（P=0.45）频率分布在两组间的差异均无统计学意义，T-T型因为频率＜0.03而未纳入分析。见表2。

2.2急性期精神分裂症患者外周血中ANK3基因mRNA的相对表达水平 急性期精神分裂症患者组ANK3基因mRNA相对表达水平为（1.12±0.22），略高于对照组（1.02±0.24），但差异无统计学意义（t=1.39，P=0.16）。

3　讨论

表1　患者组和对照组ANK3基因2个SNPs位点基因型和等位基因分布[n（%）]

近年来，精神分裂症“神经发育假说”得到越来越多证据支持[1]，ANK3基因编码的Ankyrin-G在神经发育过程中必不可少[3]，在中枢神经系统中具有影响离子通道集聚与动作电位产生、维护神经细胞的极性、神经发生、神经保护等功能[11-13]。ANK3基因遗传变异和表达异常介导神经发育异常，这些均与精神分裂症相关[5,8]。本研究对456例中国汉族精神分裂症患者和495名健康对照者的 ANK3基 因多 态 性位 点 rs10994336和rs10994359进行分析，没有发现2个位点与精神分裂症之间的关联。随后比较30例急性期精神分裂症患者和26名健康对照者外周血ANK3基因mRNA的表达水平，也没有发现急性期精神分裂症患者外周血ANK3基因表达水平异常。

表2　患者组和对照组rs10994336-rs10994359单体型频率[n（%）]

迄今为止，对于位点rs10994336与精神分裂症关系的研究结论存有争议。YUAN等[5]在中国上海进行的研究中发现该位点与精神分裂症有关联；然而TESLI等[6]和GELLA等[7]在北欧和德国人群中发现该位点多态性与精神分裂症的发病风险无关。本研究结论与TESLI等[6]和GELLA等[7]研究结论一致。比较本研究样本和YUAN等[5]研究样本的等位基因频率，发现这2个研究的对照样本中该位点等位基因频率分布具有一定差异（本研究的MAF为0.218，YUAN等[5]研究的MAF为0.26），这提示该位点可能因为样本来源地域不同而存在人群差异。另外，精神分裂症的发病机制极为复杂，具有很高的遗传异质性，这可能也是导致研究结论不一致的原因。2011年精神疾病基因组学协会精神分裂症工作小组[4]进行大样本GWAS，发现ANK3基因的一个新关联位点rs10994359。遗憾的是，本研究未能重复该位点的阳性结果，分析原因可能是因为样本量、遗传背景、生活环境等差异所致。由于本研究仅考察rs10994336和rs10994359 2个位点与精神分裂症的关系，因此不能排除ANK3基因区域内其他位点对精神分裂症易患风险的贡献。在本研究基因表达水平分析中，没有发现急性期精神分裂症患者外周血ANK3基因mRNA表达水平异常。由于基因表达在中枢和外周血中的复杂性[8-9]，ANK3基因在脑中的表达水平及其与精神分裂症的关系尚有待进一步研究。

本研究从基因多态性、基因表达2个层面对ANK3基因与精神分裂症的关系展开研究，2个层次的研究结果一致，即在本研究人群中未发现ANK3基因对精神分裂症的发生发展产生影响。在基因多态性研究中，本研究的统计功效较大，假阴性的可能性较小，结果对未来中国汉族精神分裂症ANK3基因的研究有一定参考价值。

不同人种以及相同人种在不同区域产生的遗传背景差异是群体遗传学研究结果难以得到重复性验证的主要原因之一。本研究只涉及ANK3基因的2个位点，忽视了该基因区域内其他位点，在今后的研究中可以进行高密度的SNPs检测。而本研究中基因表达分析的样本量偏小，限制了该部分分析的统计功效，未来研究将进一步扩大样本量，以期获得更严谨的结果。

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（责任编辑：肖雅妮）

R749.3

A

10.3969/j.issn.1002-0152.2016.09.007

☆国家自然科学基金（编号：81160171）

*昆明医科大学第一附属医院精神科（昆明 650032）△云南省精神卫生中心

（E-mail：xfxu2004@sina.com）

2016-03-14）