HPLC检测苦荞制品中黄曲霉毒素B1的可行性探讨

林巧，巩发永，肖诗明

（西昌学院苦荞麦重点实验室，四川西昌 615000）

HPLC检测苦荞制品中黄曲霉毒素B1的可行性探讨

林巧，巩发永，肖诗明

（西昌学院苦荞麦重点实验室，四川西昌 615000）

本试验对HPLC测定苦荞制品中AFB1的可行性进行研究，研究HPLC法测定黄曲霉毒素B1的标准曲线、准确度、精密度、系统误差、灵敏度，结果表明HPLC分析方法的检测范围0.20μg/L～200.00μg/L，判定系数R2=0.996 8，各个数据的相对误差分别是7.09%、5.28%、4.55%、0.23%，苦荞芯粉平均加标回收率为84.58%，检测出苦荞面、苦荞羹、苦荞茶中黄曲霉毒素Bl的变异系数分别是9.36%、5.25%、8.22%。检测灵敏度最低检测限0.20μg/L。

HPLC；黄曲霉毒素B1；苦荞制品；方法学

本试验试图对HPLC法定量检测黄曲霉毒素B1的可行性进行的系统研究。通过研究HPLC法测定黄曲霉毒素B1的标准曲线、精密度、灵敏度、准确度和不同苦荞制品对检测结果的影响，建立了HPLC方法评价指标，确立了HPLC定量分析的质控参数，证实HPLC方法用于苦荞制品中黄曲霉毒素B1检测具有可行性。

1 材料与方法

1.1 试验试剂和材料

三氟乙酸、正己烷、乙腈、黄曲霉素B1标准品：中国标准计量局；苦荞面、苦荞羹、苦荞粉、苦荞茶：西昌航飞苦荞科技发展有限公司。

1.2 仪器和设备

高效液相色谱系统（反相C18柱，荧光检测器）：安捷伦科技有限公司；HZK-FA210电子天平：美国华志；台式高速冷冻离心机：上海赵迪。

1.3 方法

1.3.1 绘制HPLC检测毒素B1的标准曲线

为了考察HPLC范围，需绘制HPLC黄曲霉毒素B1的标准曲线。将黄曲霉毒素B1标准液浓度按0.00、25.00、50.00、100.00、200.00μg/L依次加到高效液相色谱中，并严格按照HPLC的检测步骤依次操作，测得峰面积，以标液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标来绘制检测曲线。

1.3.2 HPLC检测曲霉毒素B1的准确度

用相对误差来衡量该方法的准确度[7]。为了研究

用HPLC测定黄曲霉毒素B1的准确度，精确吸取0.00、25.00、50.00、100.00、200.00μg/L黄曲霉毒素B1标品溶液20μL重复进样3次可以计算出相对误差，相对误差应小于10%。

1.3.3 HPLC测定黄曲霉毒素B1的系统误差

用样品加标回收率试验来衡量该方法的系统误差[8]。为研究HPLC测定黄曲霉毒素Bl的系统误差，将浓度为12.50、25.00、50.00、100.00、200.00μg/L的黄曲霉毒素标液，分别添加50μL到5.00 g的苦荞粉样品中，制备不同污染程度的样品[9]，按照测定苦荞样品中黄曲霉素B1的含量。回收率不低于70%[10]。

式中：P为加标回收率，%；C1为试样浓度，μg/L；C2为加标试样浓度，μg/L；C3为加标量，μg/L。

1.3.4 HPLC检测曲霉毒素B1的精密度

用变异系数来衡量该方法的精密度[11]。为了研究HPLC测定黄曲霉毒素B1的精密度，分别取5.0g苦荞粉、苦荞茶、苦荞面样品5份，处理后测定黄曲霉毒素B1的含量，并按照下列公式计算其变异系数，变异系数CV越小，精密度越好。当HPLC法的变异系数的值小于10%时[10]，可认为该试验的精密度好。

式中：SD为标准偏差；Xi为样品中霉毒素B1的含量，μg/kg；X为黄曲霉毒素B1的平均含量，μg/kg；n为样品组数；CV为变异系数，%。

1.3.5 HPLC检测曲霉毒素B1的灵敏度

用信噪比来衡量该方法的灵敏度[12]。为了研究HPLC测定黄曲霉毒素B1的灵敏度，先进空白溶剂，测出噪音峰高N。再进样0.10、0.15、0.20、0.25μg/L的黄曲霉毒素B1标品，当检测浓度的色谱峰高是噪音色谱峰高的3倍，即信噪比S/N=3时，该浓度即为最小检测浓度。

1.4 HPLC检测曲霉毒素B1含量的方法

1.4.1 样品的处理及制备

取5 g粉碎苦荞样品至50mL的离心管中，加入20mL乙腈-水（84+16，体积比）提取液，在电动振荡器上震荡30min，1000 r/min真空离心15min，取上清液。

1.4.2 试样净化

移取约8mL上清液至多功能净化柱，插入玻璃管中并缓慢推动填料管，收集净化液。

1.4.3 试样衍生化

将2μL净化液转移塞小瓶中，注意避光。在烘干机中（85±1）℃吹干。加入100μL三氟乙酸和200μL正己烷，密闭混匀30 s后，在（40±1）℃烘干箱中衍生15min再用温吹干。以水-乙腈（85+15，体积比）200μL溶解，混匀30 s，1 000 r/min真空离心15min，取上清液样品瓶中备用。

1.4.4 标准溶液的制备

准确移取2.00μg/mL黄曲霉毒素B1标准品1mL至10mL容量瓶中，配置浓度为200.00μg/L的标准溶液；取5mL浓度为200.00μg/L的标准溶液至10mL容量瓶中配制成100.00μ/L的标准溶液；取5mL浓度为100.00μg/L的标准溶液至10mL容量瓶中配制成50.00μg/L的标准溶液；取5mL浓度为50.00μg/L的标准溶液至10mL容量瓶中配制成25.00μg/L的标准溶液；吸取标准溶液200μL，在烘干机中85℃吹干，衍生化方法同1.4.3。

1.4.5 测定及条件

色谱柱：4.6mm×150mm，5μm，C18；柱温：30℃；流动相：乙腈（色谱纯）17%，水83%；流速：0.50mL/min；进样量：20μL；荧光检测器：激发波长：360 nm：发射波长440 nm[13]。

1.4.6 测定

以标准品的峰面积对浓度绘制标准曲线，通过保留时间的比较确定黄曲霉毒素B1的峰，根据峰面积计算试样中黄曲霉毒素B1含量。计算样品中黄曲霉毒素B1的浓度：

式中：C为试样中黄曲霉毒素B1的浓度，μg/L；A为试样按照外标法在标准曲线中对应的浓度，μg/L；V为试样提取液体积，mL；m为试样的取样量，g；f为试样溶液衍生后较衍生前的浓缩倍数。

2 结果与分析

2.1 HPLC检测曲霉毒素B1的标准曲线

将黄曲霉毒素 B1标准液浓度按 0.00、25.00、50.00、100.00、200.00μg/L依次衍生后在激发波长为360 nm，发射波长为440 nm柱温为30℃的条件下分别进样20μL，测定出AFB1的峰面积，见图1，黄曲霉毒素B1样品色谱图见图2。

图1 黄曲霉毒素B1标品色谱图Fig.1 The chromatogram of the AFB1

图2 黄曲霉毒素B1样品色谱图Fig.2 The chromatogram of the AFB1

以峰面积为纵坐标绘制标准曲线，黄曲霉毒素B1的浓度为横坐标，得回归方程Y=0.074 1X+0.033，R2= 0.9968，黄曲霉毒素B1含量的标准曲线。黄曲霉素B1含量高并且判定系数为0.996 8接近1，说明在0.20μg/L～200.00μg/L范围内HPLC法所绘制的标准曲线的线性相关性较好。HPLC检测霉毒素B1的标准曲线见图3。

图3 HPLC检测霉毒素B1的标准曲线Fig.3 HPLC standard curvemethod for thedeterm ination of aflatoxin B1

2.2 HPLC检测曲霉毒素B1的准确度

黄曲霉毒素B1标液精确吸取0.00、25.00、50.00、100.00、200.00μg/L黄曲霉毒素B1标品溶液20μL重复进样3次可以计算出相对误差，见表1。

表1 HPL检测曲霉毒素B1的准确度Table1 Accuracy of HPLC for determ ination of aflatoxin B1

由表1可知HPLC法中各个数据的相对误差分别是7.09%、5.28%、4.55%、0.23%均在国家规定的10%以内，说明HPLC法的准确度良好。

2.3 HPLC检测曲霉毒素B1的系统误差

该方法的系统误差用样品加标回收率试验来衡量，别为12.50、25.00、50.00、100.00、200.00μg/L的黄曲霉毒素标液，添加50μL到5.00 g的苦荞粉样品中，制备不同污染程度的样品，加标样品经提取、净化和衍生后，按照HPLC法测定加标样品中黄曲霉素B1的含量，见表2。

表2 HPLC检测荞芯粉中黄曲霉毒素B1的回收率Table2 Determ ination of Tartary Buckwheat core powderrecovery of aflatoxin B1in the rateof HPLCmethod

由表2可知，在12.50μg/L～200.00μg/L范围内，本方法的加标回收率介于80.20%～89.50%之间，符合技术要求；平均回收率是84.58%，高于最低回收率70%，说明HPLC法的系统误差在符合要求内。

2.4 HPLC检测曲霉毒素B1的精密度

为了研究HPLC测定黄曲霉毒素B1的精密度，分别取5.00 g苦荞面、苦荞羹、苦荞茶样品5份，处理后测定黄曲霉毒素B1的含量，计算其变异系数，见表3。

表3 HPLC法检测黄曲霉毒素B1的精密度Table3 The precision of HPLCm ethod for thedeterm ination ofaflatoxin B1

由表3可知，HPLC测定苦荞面、苦荞羹、苦荞茶中黄曲霉毒素B1的变异系数分别是9.36%、5.25%、8.22%，国标GB/T17480-2008《食品中黄曲霉毒素B1的测定酶联免疫吸附法》规定变异系数应小于10%，以上数据均小于10%，说明HPLC法的精密度良好。

2.5 HPLC检测曲霉毒素B1的灵敏度

先进0μg/L黄曲霉毒素B1标品，测出出峰附近噪

音信号N为0.0015 mAU，再进样0.10、0.15、0.20、0.25μg/L的黄曲霉毒素B1标品，测出信号S，计算由S/N，见表4。

表4 HPLC检测黄曲霉毒素B1的灵敏度Table4 Sensitivity of HPLC for determ ination of aflatoxin B1

由表4可知，当黄曲霉毒素Bl浓度为0.20μg/L时，色谱峰高为噪音峰高的3倍。因此HPLC的最低检测浓度为0.20μg/L。

3 讨论与结论

本试验建立了HPLC分析方法的质控参数并对苦荞制品检测性能和可靠性作了详细的分析。结果显示：HPLC法的绘制标准曲线，判定系数R2=0.996 8接近1，符合检测要求；在0.20μg/L～200.00μg/L范围内，苦荞粉的加标回收率介于80.20%～89.50%之间，符合技术要求；平均回收率是84.58%，高于最低回收率70%。HPLC测定苦荞面、苦荞羹、苦荞茶中黄曲霉毒素B1的变异系数分别是9.36%、5.25%、8.22%，小于10%，符合国标GB/T17480-2008《食品中黄曲霉毒素B1的测定酶联免疫吸附法》规定要求，HPLC法中最低检测浓度为0.20μg/L。

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The Feasible Discussion about A flatoxin B1Determ ination in Tartary Buckwheat Products by HPLC

LINQiao，GONGFa-yong，XIAOShi-ming
（Buckwheat Laboratory of Xichang College，Xichang 615000，Sichuan，China）

Feasibility ofdeterminingaflatoxin B1in tartary buckwheatproductsby HPLCwas researched by analyzing the standard curve，accuracy，precision，the system error and sensitivity.The results showed thatusing HPLC to determine the aflatoxin B1in tartary buckwheat products，the detection range was 0.20μg/L～200.00μg/L，determination coefficientR2was0.996 8，the relative errorwas7.09%、5.28%、4.55%、0.23% respectively，theaverage recovery ofstandard addition in buckwheatcore flourwas84.58%，the variation coefficientofbuckwheatnoodles，buckwheatsoup and buckwheat teawas9.36%，5.25%，8.22%respectively，and the detection sensitivity reached 0.20μg/L.

HPLC；aflatoxin B1；tartarybuckwheatproducts；methodology

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.23.034

2016-01-28

四川省教育厅重点科研基金项目（13ZA0157）

林巧（1978—），女（汉），副教授，硕士，研究方向：食品品质与安全管理。