福林酚比色法测定酸浆宿萼中总多酚含量

张洋婷，郗艳丽，葛红娟，冯小雨，马洪波

（吉林医药学院公共卫生学院，吉林吉林132013）

福林酚比色法测定酸浆宿萼中总多酚含量

张洋婷，郗艳丽，葛红娟，冯小雨，马洪波*

（吉林医药学院公共卫生学院，吉林吉林132013）

优化福林酚法测定酸浆宿萼总多酚含量的条件，并对其进行分析评价。结果表明：样本0.5mL，福林酚用量1.0mL，10%Na2CO3用量8mL，当反应时间为2.5 h，反应温度为20℃，在波长760 nm处测定时，总多酚的含量与吸光度呈良好的线性关系，该方法操作简便、灵敏度高、精密度高，稳定性好，适宜酸浆宿萼总多酚含量的测定。

酸浆宿萼；福林酚；多酚

酸浆 （Physalis alkekengi L.var.franchetii（Mast）Makino）是茄科酸浆属，多年生宿根草本植物，又名红姑娘、挂金灯等[1]。成熟时红似玛瑙，外观美丽，酸甜可口，全身可入药[2]。酸浆宿萼为药典中明确规定的药用部位，其味酸、苦，性寒，具有清热解毒、利咽化痰、利尿等作用[3]。在我国部分地区，有将酸浆宿萼晒干后当茶饮的习俗，可清热去火。植物多酚是一类具有独特生理活性和药理活性的天然产物，广泛存在于水果、蔬菜、茶叶和咖啡等植物体内[4-5]。大量研究表明，植物多酚在抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、抗炎杀菌、保护心血管等很多方面具有显著的作用[6-11]，因而，在制药、生化、日化、食品以及精细化工等领域具有广泛的应用前景[12]。

多酚类物质含量的测定方法较多，例如高锰酸钾法、酒石酸亚铁比色法、福林酚比色法、紫外分光光度法、原子吸收法和高效液相色谱法等[13-17]，相比较而言，福林酚法操作简单，重现性好，是目前测多酚的通用方法。但福林酚法目前尚未有统一的实验条件，文献报道各种植物提取物的测定条件，例如福林酚用量，碳酸钠的浓度和用量、反应体系体积、反应时间及温度等都不尽相同。因此，本试验旨在优化福林酚法测定酸浆宿萼总多酚含量的条件，建立一种便捷、准确的测定方法，为进一步研究酸浆宿萼总多酚生物活性提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酸浆宿萼：采购于吉林省吉林市丰满区，经自然风干后，粉碎，置于干燥器中，备用。

碳酸钠、无水乙醇、没食子酸、福林酚：均为分析纯，市购。

1.2 仪器与设备

AF-20A型高速粉碎机：温岭市奥力中药机械有限公司；FA1104N电子天平：上海精密科学仪器有限公司；KQ-100DB型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；HHS型电热恒温水浴锅：上海博讯实业有限公司；722可见分光光度计：上海欣茂仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 条件的优化

1.3.1.1 测定波长的确定

分别移取样品液和没食子酸标准溶液各0.5mL于具塞试管中，加入5mL蒸馏水，混匀后加入1.0mL福林酚试剂，静置1min后加入10mL10%Na2CO3溶液，加蒸馏水定容至25mL，室温下避光反应2.5 h，在500 nm～900 nm波长范围内测定吸光值，从而选择最佳测定波长。

1.3.1.2 10%Na2CO3溶液用量的确定

精密移取5份0.5mL样品液于25mL具塞试管中，加入5mL蒸馏水，混匀后加入福林酚显色剂1.0mL，静置1min后分别加入10%Na2CO3溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL，蒸馏水定容至25mL，室温下避光反应2.5 h后，在最佳波长处测定吸光值，以确定10% Na2CO3溶液的用量。

1.3.1.3 福林酚用量的确定

取6份0.5mL样品液于25mL具塞试管中，加入5mL蒸馏水，混匀后加入福林酚显色剂0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL，静置1min后加入10mL10%Na2CO3溶液，加蒸馏水定容至25mL，室温下避光反应2.5 h后，在最佳波长处测定吸光度，以确定福林酚的用量。

1.3.1.4 显色温度的确定

取5份0.5mL样品液于25mL具塞试管中，加入5mL蒸馏水，混匀后加入福林酚试剂1.0mL混匀，静置1min后加入10mL10%Na2CO3溶液，加蒸馏水定容至25mL，分别在15、20、25、30、35℃条件下水浴避光反应2.5 h，在最佳测量波长处进行吸光度，以确定适宜的反应温度。

1.3.1.5 显色时间的确定

取6份0.5mL样品液于25mL具塞试管中，加入5mL蒸馏水，混匀后加入福林酚显色1.0 mL，静置1min后加入10mL10%Na2CO3溶液，蒸馏水定容至刻度，在最佳温度下避光反应1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h后，在最佳测量波长处进行吸光度，以确定适宜的反应时间。

1.3.2 样品中总多酚含量的测定

分别移取没食子酸标准液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、 1.2mL，置于25mL具塞试管中，加入5mL蒸馏水，混匀后加入1.0mL福林酚显色剂，静置1min后加入10%Na2CO3溶液8mL，加蒸馏水定容至刻度，20℃下避光反应2.5 h后，在760 nm处测定吸光度，以没食子酸溶液质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。取待测样品0.5mL于具塞试管中，其他操作同上，根据标准曲线计算出样品中总多酚的含量。

1.3.3 分析方法的评价

1.3.3.1 精密度试验

取5份0.5mL样品于具塞试管中，按优化后的条件测定吸光度。计算相对标准偏差，评价分析方法的精密度。

1.3.3.2 稳定性试验

取0.5mL样品于具塞试管中，按优化后的条件进行操作，于20℃条件下避光分别放置0.5、1、1.5、2、2.5、3、4 h后在760 nm处测定吸光度。计算相对标准偏差，评价分析方法的稳定性。

1.3.3.3 加标回收试验

取5份0.5mL样品于具塞试管中，分别加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL没食子酸标准溶液，按优化的条件测定吸光度。计算没食子酸的平均回收率和试验结果的相对标准偏差，评价试验方法的可靠性。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验

2.1.1 最佳测定波长的确定

研究表明福林酚试剂与多酚物质的反应在680 nm～780 nm处有较大吸收。取样品适量，经过溶剂提取后，得到供试原液。常温避光反应2.5 h后，以蒸馏水为空白，500 nm～900 nm可见光区下扫描，样品和没食子酸标准溶液的光谱吸收曲线见图1。

图1 样品（a）和没食子酸标准溶液（b）的光谱吸收曲线Fig.1 Spectralabsorption curveof sample（a）and standard gallic acid solution（b）

从图1可以看出两者均在760 nm有最大吸收，故选760 nm为检测波长。

2.1.2 10%Na2CO3溶液用量的确定

碳酸钠溶液是福林酚法测定多酚反应的缓冲液，碳酸钠对显色效果的影响见图2。

图2 10%Na2CO3用量对反应的影响Fig.2 Effectsof volum esof 10%Na2CO3on absorbance

从图2可知，吸光度值随着10%Na2CO3用量的增加而增大，当10%Na2CO3溶液用量为8mL时，吸光度值达到最大；此时，继续增加10%Na2CO3用量，吸光度值则减少，所以10%Na2CO3溶液的最佳用量为8mL。

2.1.3 福林酚用量的确定

福林酚试剂与多酚物质结合在碱性条件下呈蓝色，福林酚试剂对反应显色效果的影响如图3所示。

图3 福林酚用量对反应的影响Fig.3 Effectsof volum esof Folin Ciocalten reagenton absorbance

由图3可以看出，福林酚试剂用量小于1.0mL时，吸光值增加明显，福林酚试剂大于1.0mL时，吸光值增加不明显，趋于稳定。因此，选择选择福林酚试剂加入量为1.0mL。

2.1.4 显色温度的确定

温度会影响多酚物质的稳定性。在相同的反应条件下，温度对显色效果的影响见图4。

由图4可知，反应温度在15℃～20℃范围内时，吸光度值随着温度的增加而降低；当显色温度大于20℃时，吸光值则随着温度的增加而降低。所以，最佳反应温度确定为20℃。

图4 显色温度对反应的影响Fig.4 Effectof tem peratureon absorbance

2.1.5 显色时间的确定

显色时间不足会影响测量结果的准确性，显色时间对显色效果的影响如图5所示。

图5 显色时间对反应的影响Fig.5 Effectof reaction timeon absorbance

由图5可知，当显色时间在1.0 h～2.5 h内时，吸光度值随着显色时间的增加且逐渐增大，2.5 h对应的吸光度值最大；当显色时间大于2.5 h时，吸光度值的变化幅度不大，基本持平。考虑到时间过长不利于试验操作，因此，确定反应时间为2.5 h。

2.2 样品中总多酚含量的测定

以没食子酸溶液质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。回归方程为y=0.116x-0.028 5，相关系数R2=0.998 9。取0.5mL待测样品，按照上述方法测定其的吸光度为0.059，计算出酸浆宿萼提取物总多酚含量为9.495mg/g。

2.3 分析方法评价

2.3.1 精密度试验

将同一份样品反应液连续测定6次吸光度值，相对标准偏差RSD为0.82%，说明该仪器精密度良好。

2.3.2 稳定性试验

按照已确定的反应条件制备5份平行样品溶液，分别测定其吸光度值，相对标准偏差（RSD）为2.78%，

说明该方法重现性良好。

2.3.3 加标回收试验

加标回收试验结果见表1。

表1 加标回收试验结果Table1 Resultof average recovery experim ent

从表1可以看出各组的回收率在95.3%～104.9%，平均回收率100.1%，相对标准偏差（RSD）为3.89%，说明该分析方法可靠，可用于酸浆宿萼多酚含量的测定。

3 结论

在参考GB/T 8313-2008《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》[18]的基础上，对福林酚法测定酸浆宿萼总多酚含量的条件进行探索。得出福林酚比色法测定酸浆宿萼的适宜条件为：10%Na2CO3溶液用量8mL，福林酚试剂用量为1.0mL，20℃避光反应2.5 h，在760 nm处检测酸浆宿萼中多酚类物质的吸光度值。并且该方法的平均回收率为100.1%，相对标准偏差为3.89%，可用于酸浆宿萼中总多酚含量的测定。

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Determ ination of Total Polyphenols in Calyx Physalis by Folin-ciocalteu M ethod

ZHANGYang-ting，XIYan-li，GEHong-juan，FENGXiao-yu，MA Hong-bo*
（SchoolofPublic Health，Jilin MedicalUniversity，Jilin 132013，Jilin，China）

Theoptimum condition on determining totalpolyphenols content in calyx physalisby Folin-ciocalteu method was studied.The results indicated that the optimum conditions for total polyphenols determination by Folin-Ciocalteu were as follows：1.0mL of Folin-ciocalteu reagentwas added in 0.5mL of sample，and then 8mL of10%sodium carbonate solution wasadded.After the coloration reactionwas for2.5 h at20℃，the opticaldensitywasmeasured at760 nm.Under theoptimum conditions，theabsorbance increased linearlywith the concentration of gallic acid.Themethod is fast，highly precise and stable，and suitable for determining total polyphenol contentin calyx physalis.

calyx physalis；Folin-ciocalteu；polyphenol

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.23.032

2016-09-13

吉林省教育厅“十二五”科学技术研究项目（2013360）；吉林省卫生计生课题（2014ZC063）；吉林省教育厅项目（2015403）

张洋婷（1986—），女（汉），助教，硕士，研究方向：营养与食品卫生。

*通信作者：马洪波（1969—），男（汉），副教授，硕士。