柿叶黄酮超声辅助提取工艺及其抗氧化性研究

卢鑫，张琳

（济源职业技术学院，河南济源459000）

柿叶黄酮超声辅助提取工艺及其抗氧化性研究

卢鑫，张琳

（济源职业技术学院，河南济源459000）

研究超声波辅助提取柿叶总黄酮的工艺条件及其抗氧化活性。采用单因素试验与正交试验，考察乙醇浓度、固液比、超声功率、浸提温度及提取时间等因素对柿叶总黄酮提取率的影响，并以柿叶总黄酮体外清除DPPH自由基能力为指标，评价其抗氧化活性。结果表明，超声波辅助提取柿叶总黄酮最佳工艺条件为乙醇浓度为70%，固液比1∶20（g/mL），超声功率350W，超声时间40min，浸提温度55℃，提取2次，柿叶总黄酮得率约为0.70%（以干柿叶计）；在0～100μg/mL范围内，柿叶总黄酮抗氧化能力高于VC，对DPPH自由基的体外清除率达85.96%；超过100μg/mL时，清除作用基本稳定不变，浓度和清除率不显示量效关系。通过拟合线性方程计算柿叶总黄酮的IC50值为5.45μg/m L，表明柿叶黄酮是良好的抗氧化剂。

柿叶总黄酮；提取工艺；抗氧化性

柿叶是柿树科柿树属柿树种植物的鲜叶或干燥叶，是重要的中药资源。用柿叶制成的中成药已经用于临床实践，广州白云山中药厂“脑心清”的组方就只有柿叶一味中药，临床实践证明它对治疗心血管疾病有确切的疗效；广西生产的“脑心宁”以柿叶为主药，能改善患者血液的浓、黏、凝聚状态，达到改善心脑组织缺血、缺氧的目的。在保健食品方面，用柿叶制成的柿叶茶曾风靡日本、韩国，至今仍然不衰，我国对柿叶茶

开发研究利用的文章也有报道[1-4]。柿叶中主要的药用成分为黄酮类、萜类、酚类、VC和胡萝卜素等对人体有益的天然化学物质。杨建雄等研究发现柿叶黄酮有明显的抗氧化作用[5]。欧阳平等研究发现柿叶黄酮对糖尿病、冠状动脉粥样硬化和机体衰老等疾病的发生发展过程均有一定的抑制作用[6]。除此之外，柿叶黄酮还有止血、抗菌、解热、抗过敏，增强免疫等功能。近年来，不少国内外学者利用超声波产生的强烈振动、空化效应、高加速度和搅拌作用，把超声波提取技术应用到天然产物提取分离中，使该领域有了很大的发展，超声波辅助提取不仅能使有效成分提取率增高，而且可以降低温度，有利于保护有效成分[7]。本文对采用超声波辅助提取柿叶中黄酮类化合物的工艺及其抗氧化性能进行了研究，旨在为废弃柿叶资源化利用和功能性保健柿叶产品的研发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

柿叶：采自河南王屋山，自然干燥后粉碎并过60目筛得柿叶粗粉，密封备用；芦丁标准品：中国药品生物制品检定所；乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、乙酸乙酯：均为分析纯；试验用水：为去离子水。

1.2 主要仪器与设备

KQ-500E型超声波发生器：上海昆山仪器有限公司；501BS超级恒温水浴锅：江苏常州科迈试验仪器有限公司；FW100微型植物粉碎机：天津泰斯特仪器有限公司；XR205Sm-DR电子天平：瑞士普利塞斯分析天平；3K-30高速离心机：上海安亭科技仪器厂；RE-5298A旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；UV-1801型紫外可见分光光度计：北京瑞利分析仪器公司。

1.3 柿叶总黄酮的提取工艺

1.3.1 柿叶总黄酮的超声波辅助提取工艺流程

柿叶—风干—粉碎—过60目筛—称量—乙醇超声波浸提—室温过滤—浓缩—黄酮总含量测定

1.3.2 柿叶总黄酮提取的单因素试验

准确称取一定质量的干燥柿叶，按一定的料液比加入一定浓度的乙醇溶液在一定的超声波功率下超声浸提一定的时间，冷却至室温过滤，用少量乙醇洗涤滤渣，提取一定的次数，合并滤液，滤液水浴旋转蒸干，用0.1mol/L的NaOH溶液定量溶解，3 000 r/min离心15min，收集上清液，定容至50mL备用，以芦丁为标准物质，测得总黄酮得率。分别考察乙醇浓度、超声功率、浸提温度、液固比、提取时间、提取次数对柿叶总黄酮得率的影响，确定各因素最佳水平[8-10]。

1.3.3 柿叶总黄酮提取的正交试验

在综合单因素试验的基础上，选择乙醇浓度（A）、超声功率（B）、提取时间（C）和液固比（D）作为影响因素，仍以柿叶总黄酮的得率为目标做正交试验，用L9（34）正交表进行试验方案设计，正交试验的因素和水平见表1。

表1 正交试验因素水平Table1 Factorsand levelsof orthogonal test

1.4 柿叶总黄酮含量的测定

1.4.1 标准曲线的绘制

准确称取干燥至恒重的芦丁标准品10.0mg，用60%乙醇溶解定容至50mL容量瓶中，制得浓度为0.2mg/mL的芦丁标准液。取0.2mg/mL的芦丁标准液0、2、4、6、8、10mL于25mL容量瓶中，加入5%NaNO2溶液1mL，摇匀静置6min，再加入10%Al（NO3）3溶液1mL，摇匀静置6min，再加入4%NaOH溶液5mL，摇匀，用60%乙醇溶解定容，静置15min后于510 nm处测定吸光度（A）。以浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标作标准曲线（见图1），得其回归方程y= 8.856 3x+0.003，R2=0.999 6，测定范围，0～0.080mg/mL，线性关系良好。

图1 芦丁对照品标准曲线Fig.1 Standard curveof rutin

1.4.2 总黄酮含量的测定

取一定量的备用样品25mL容量瓶中，加入5% NaNO2溶液1 mL，摇匀静置6 min，再加入10% Al（NO3）3溶液1mL，摇匀静置6min，再加入4%NaOH溶液5mL，摇匀，用60%乙醇溶解定容，静置15min后于510 nm处测定吸光度（A）。根据标准曲线，计算不同试验组提取液的柿叶总黄酮含量，并计算得率。柿叶总黄酮得率（Y）/%=（提取物中总黄酮的质量/原料的质量）×100。

1.5 柿叶总黄酮的抗氧化性能试验

1.5.1 DPPH（二苯基苦基苯肼）溶液配制

准确称取7.9mgDPPH，用无水乙醇溶液溶解并定容于100mL棕色容量瓶中，摇匀，放置于冰箱中备用。

1.5.2 DPPH自由基清除能力的测定

取上述DPPH无水乙醇溶液2mL于不同比色管中，再分别加入50、100、150、200、250、300μg/mL柿叶总黄酮溶液2mL于同一支具比色管中，充分混合，静置30min，在517 nm测定其吸光度AS值，每一组吸光度平行测3次，取其平均值[11]。

式中：A0为2mLDPPH自由基溶液加2mL无水乙醇的吸光度；A为2mL无水乙醇加2mL试样的吸光度；AS为2mLDPPH自由基溶液加2mL试样的吸光度。

柿叶总黄酮抗氧化活性采用对DPPH自由基的体外清除率和柿叶总黄酮的IC50值表示，为了比较评价抗氧化能力，试验中用VC做阳性对照。

2 结果与分析

2.1 柿叶总黄酮提取的单因素试验

2.1.1 乙醇浓度对柿叶总黄酮得率的影响

试验中固定超声时间15min，功率350W，温度50℃，固液比1∶20（g/mL），考察的乙醇浓度分别为0%、30%、50%、60%、70%、80%、95%。乙醇浓度对柿叶总黄酮得率的影响见图2。

图2 乙醇浓度对柿叶总黄酮得率的影响Fig.2 Effectof ethanolconcentration on extraction rateof total flavonoids from persimm on leaves

由图2可知柿叶总黄酮得率随乙醇浓度增高先增大，在乙醇浓度70%处，有最高峰值，随后，得率随乙醇浓度增高而减小。这可能是因为柿叶中含有极性较大的黄酮苷和极性极低的黄酮苷元所致，低浓度的乙醇易提取高极性的黄酮苷，而高浓度的乙醇易提取出低极性的黄酮苷元，用70%的乙醇提取时，两种类型的黄酮都可以提取出来，所以总黄酮含量最高。因此选择60%～80%的浓度范围进行正交试验。

2.1.2 超声功率对柿叶总黄酮得率的影响

试验中固定乙醇浓度70%，超声时间15min，温度50℃，固液比1∶20（g/mL），考察的超声功率分别为250、300、350、400、450W。超声功率对柿叶总黄酮得率的影响见图3。

图3 超声功率对柿叶总黄酮得率的影响Fig.3 Effectofultrasonic power on the yield of total flavonoids from persimmon leaves

由图3可知，柿叶总黄酮得率随着功率的增大先增大后减少，在350W附近有最大值，因此选择300W～400W的功率范围进行正交试验。

2.1.3 浸提温度对柿叶总黄酮得率的影响

试验中固定乙醇浓度70%，超声时间15min，超声功率350W，固液比1∶20（g/mL），考察的浸提温度分别为30、40、50、60、70℃。浸提温度对柿叶总黄酮得率的影响见图4。

图4 浸提温度对柿叶总黄酮得率的影响Fig.4 Effectof extraction tem peratureon the yield of total flavonoids from persimm on leaves

由图4可知，柿叶总黄酮得率随浸提温度升高而缓慢增加，60℃以后有明显降低趋势，这有可能是黄酮类物质结构易被高温破坏所致，考虑温度较高时，杂质的浸出率也会提高，不利于后期纯化，也从节约能源角度考虑，选取浸提温度55℃。

2.1.4 固液比对柿叶总黄酮得率的影响

试验中固定乙醇浓度70%，超声时间15min，超声功率350W，浸提温度55℃，考察的固液比分别为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）。固液比对柿叶总黄酮得率的影响见图5。

由图5可知，柿叶总黄酮得率随固液比增大而增大，这是因为溶液量大，黄酮类物质在植物到液体本体间浓度差大，有利于传质进行，固液比在1∶20（g/mL）

以后增大变得缓慢，考虑液固比过大会造成杂质过多的浸出，因此选择1∶10（g/mL）～1∶20（g/mL）的固液比范围进行正交试验。

图5 固液比对柿叶总黄酮得率的影响Fig.5 Effectof solid-liquid ratio on theyield of total flavones from persimm on leaves

2.1.5 提取时间对柿叶总黄酮得率的影响

试验中固定乙醇浓度50%，固液比1∶20（g/mL），超声功率350W，浸提温度50℃，考察的提取时间分别为10、25、40、55、70、85min。提取时间对柿叶总黄酮得率的影响见图6。

图6 提取时间对柿叶总黄酮得率的影响Fig.6 Effectof extraction timeon theyield of total flavonoids from persimm on leaves

由图6可知，柿叶总黄酮得率在10min到40min范围内，随着提取时间的延长明显增高，提取40min后叶总黄酮得率变化不大，这可能是在超声波作用下，溶出在较短的时间内就达到平衡了，因此选择30min～50min的提取时间范围进行正交试验。

2.1.6 提取次数对柿叶总黄酮得率的影响

试验中固定乙醇浓度60%，固液比1∶20（g/mL），超声功率350W，浸提温度50℃，提取时间30min，考察的提取次数分别为1、2、3、4次。提取次数对柿叶总黄酮得率的影响见表2。

由表2可知，浸提2次后柿叶总黄酮的得率变化不明显，因此，从节约成本及提高提取效率角度考虑，以提取2次为宜。

表2 提取次数对柿叶总黄酮得率的影响Table2 Effectof extraction timeson the yield of total flavonoids from persimmon leaves

2.2 柿叶总黄酮提取的正交试验

根据表1中选择的因素水平进行的正交试验结果与方差分析见表3和表4。

表3 正交试验及结果Table3 Resu ltsof orthogonal test

表4 方差分析Table4 Variance Analysisof orthogonal testm ethod

由表3和表4可知，超声波辅助提取柿叶总黄酮工艺中，影响柿叶总黄酮得率因素的主次顺序为：乙醇浓度>固液比>超声功率>提取时间；为检验各因素对提取率影响显著性，进行了方差分析，利用极差最小列来估计误差，F检验结果显示，乙醇浓度在α=0.05水平上显著，液固比在α=0.1水平上显著。超声波辅助提取柿叶总黄酮的最佳条件为A2B2C2D3，即乙醇的浓度为70%，超声功率为350W，提取时间为40min，固

液比为1∶20（g/mL）。最佳参数组合不在试验点以内，所以做验证试验。在最佳参数组合条件下，柿叶总黄酮类3次得率平均值为0.70%（以干柿叶计）。

2.3 柿叶总黄酮的抗氧化性能试验

DPPH是一种比较稳定的脂性自由基，每个DPPH分子在溶液中可生成一个稳定的含N自由基，在517nm处有最大吸收，具有典型的紫色，在加入抗氧化剂后，DPPH捕捉一个电子配对，紫色褪去，溶液颜色变浅，其褪色程度与其接受的电子数成定量关系。可依此原理来检定抗氧化性物的抗氧化能力。

柿叶总黄酮和VC对DPPH自由基清除率的影响见图7。

图7 柿叶总黄酮对DPPH·清除率的影响Fig.7 Persimmon leaf total flavonoidson the clearance rateof DPPH·

由图7可知，柿叶总黄酮对DPPH自由基有显著的清除作用，且随着柿叶总黄酮浓度的增大清除作用也随之增大，增大趋势在浓度达到一定值后趋于平缓；在0～100μg/mL范围内呈近似线性相关，在100μg/mL时，柿叶总黄酮对DPPH自由基的体外清除率达85.96%，超过100μg/mL时，清除作用基本稳定不变，清除率约为90.36%，浓度和清除率不显示量效关系。在0～100μg/mL范围内，柿叶总黄酮抗氧化能力高于VC，通过拟合线性方程计算柿叶总黄酮和VC的IC50值分别为5.45μg/mL和7.67μg/mL。清除率与抗氧化剂加入量的线性关系及抗氧化物质的IC50值见表5所示。

表5 清除率与抗氧化剂加入量的线性关系及抗氧化物质的IC50值Table5 Relationship between the clearance rateand antioxidant contentand the IC50valueof antioxidant substances

3 结论

本文重点讨论了柿叶总黄酮的超声波辅助提取工艺和体外抗氧化活性，在单因素试验的基础上通过正交优化柿叶总黄酮的提取工艺试验，最终确定了柿叶总黄酮超声波辅助提取的最佳工艺条件为乙醇浓度为70%，固液比为1∶20（g/mL），超声功率350W，超声时间40min，提取温度55℃，提取2次，柿叶总黄酮得率约为0.70%左右（以干柿叶计）。

通过改变柿叶总黄酮浓度对DPPH.清除率的影响研究，得出柿叶总黄酮在0～100μg/mL范围内，对DPPH自由基的体外清除作用随柿叶总黄酮浓度增加而增强；浓度超过100μg/mL时，对DPPH自由基的体外清除作用基本稳定不变，清除率约为90.36%，浓度和清除率不显示量效关系；通过拟合线性方程计算柿叶总黄酮的IC50值为5.45μg/mL，低于VC的IC50值7.67μg/mL，表明柿叶黄酮是良好的抗氧化剂。

本研究结果为柿叶资源开发提供了更多的理论基础，特别是对王屋山柿叶资源开发利用提供了参考。

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Study on the Extraction Technology by Ultrasonic Assisted and Antioxidant Activity of Total Flavonoids from Persimmon Leaves

LUXin，ZHANGLin
（Jiyuan Vocationaland TechnicalCollege，Jiyuan 459000，Henan，China）

The extraction technology by ultrasonic assisted and antioxidantactivity of total flavonoids from persimmon leaveswere studied.Single factor testand orthogonal testweremade to study the effectsofethanol concentration，solid-liquid ratio，ultrasonic power，extraction temperature and extraction time on the extraction rate of total flavonoids from persimmon leaves and clearing DPPH radical scavenging ability in vitro of total flavonoids from persimmon leaveswas taken asan index to evaluate the antioxidantactivity.The resultsshowed that the bestcondition forextraction technology by ultrasonic assisted from persimmon leaveswaswhen ethanol concentrationwas70%，solid-liquid ratiowas1∶20（g/mL），ultrasonic powerwas350W，ultrasonic timewas 40min，soaking temperaturewas55℃and extraction wasmade for 2 times，then total flavonoids from persimmon leavescould be0.70%（calculated in dry persimmon leaves；in thescopeof0-100μg/mL，theantioxidant capacity of total flavonoids from persimmon leaveswashigher than Vc，DPPH free radical scavenging rate was 85.96%；when itwasover 100μg/mL，clear effectwasbasically stable，concentration and clearance did not show the relationship between quantity and effect.By fitting the linear equation of total flavonoids from persimmon leaves，the IC50valuewas5.45μg/mL，which showed that flavonoids from persimmon leaveswere good antioxidants.

total flavonoids from persimmon leaves；extraction process；antioxidation

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.23.024

2016-02-21

济源市科技局2014年度科技攻关计划项目（14031018）

卢鑫（1971—），女（汉），副教授，本科，研究方向：天然产物化学。